182442. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunoglobulinok meghatározására
7 182 442 8 Ugyanebben az oldatban feloldott pepszint adtunk hozzá úgy, hogy az enzim és a szubsztrát arány 1:100 között legyen A keveréket 37 °C-on 20—24 órán át inkubáltuk. A reakciót TRIS-só hozzáadásával leállítottuk, és a pH-t ezzel 8-ra állítottuk. A frangenseket Sephadex G 150 oszlopon 0,1 mólos TRIS/HC1 (pH = 7,7), 0,2 mólos NaCI és 2 m mólos EDTA felhasználásával elkülönítettük. D. Az enzim-jelzett F(ab’)2 konjugát készítése A hepatitisz A vírus/antigén elleni F(ab’)2 konjugátot P. K. Nakane és A, Kawaoi eljárása (J. Histochem. Cytoch., 22 (12), 1974, 1084—1901) szerint készítettük. 5 mg torma-peroxidázt oldottunk fel 8,1 pH- ju 1 ml 0,3 mólos karbonát-pufferben és 1 % abszolút alkoholt tartalmazó, 0,1 ml fluoro-dinitrobenzolt, majd 1 ml 0,08 mólos nátrium-perjodádot adtunk hozzá. A reakciót 1 ml 0,1 mólos etilénglikol-oldattal állítottuk le. 9,5-ös pH-ju 0,01 mólos karbonát-pufferrel szemben végzett dialízis után 5 mg P(ab’)2-t adtunk az oldathoz. A F(ab’)2-t előzőleg 8,0-as pH- ju 0,05 mólos foszfátpufferrel szemben dializáltuk. Szobahőmérsékleten, 2 1/2 órán át történő reakció lejárta után az oldatot 4 °C-on, egy éjszakán át, 8,0-as pH-ju, 0,05 mólos foszfátpufferrel szemben dializáltuk. A konjugátot 4 °C-on tároltuk. E. Hepatitisz A elleni IgM antitestek meghatározása A következő vizsgálati rendszert alakítottuk ki: I. Bevonás A mikroelemző lemezek mélyedéseit bevontuk 5 fi g IgG (anti-IgM)/ml oldattal (0,05 mólos, 7,2 pH-ju foszfátpuff érijén (FP), majd szobahőmérsékleten 16 órán át inkubáltuk. A lemezeket ezt követően háromszor átmostuk FP és 0,05 % Tween 20 (FP/Tween) oldatával. II. Vizsgálandó szérum FP/Tween-ben levő 1,25 ml szérumhígítást a mélyedésekbe pipettáztuk, és 37 °C-on 4 órán át inkubáltuk, majd FP/Tweeen oldattal háromszor átmostuk. III. Antigén 0,1 ml antigén oldatot vittünk valamennyi mélyedésbe. A lemezt egy éjszakán át, szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd FP/Tween-nel négyszer átmostuk. IV. Konjugát FP/Tween-ben hígított, 0,1 ml anti-hepatitisz A—F(ab’)2 konjugátot és 5 % negatív humán szérumot pipettáztunk a mélyedésekbe és az egészet 37 °C-on 1 óráig inkubáltuk, majd FP/Tween-nel ötször átmostuk. V. Szubsztrát 1 tabletta orto-fenilén-diamint (1 tabletta 12 mg-ot tartalmaz) 30 ml desztillált vízben oldottunk (A). 1 tabletta karbamid-peroxidot (1 tabletta 4 mg-ot tartalmaz a karbamid és hidrogén-peroxid közötti abszorpciós folyamat útján képződő karbamid-peroxidból) 7,5 ml desztillált vízben .oldottunk (B). 0,5 ml B oldatot adtunk 30 ml A oldathoz. Ennek a keveréknek 0,1 ml-ét a mélyedésbe pipettáztuk, és sötétben 45 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Az enzim-szubsztrát reakcióját 0,05 ml 4 n kénsawal állítottuk le. Az orto-fenilén-diamint és karbamid-peroxidot abból a .Hepanostika reagens-csomagból vettük, amelyet a hepatitisz B antigén meghatározásához használnak (Organon Teknika, Oss, Holland). VT. Színváltozás mérése A szubsztrát színváltozása jól mérhető 492 nm-nél, Vitatron (fotométer segítségével. VII. Értékelés 5 negatív kontrollt határoztunk meg a fentiek alapján. Ennek az 5 kontrollnak az átlag extinkciója -j- a standard deviáció ötszöröse volt a határérték a negatív és pozitív szérumok között. II. példa A reumatold faktor (RF) zavaró hatását az anti-hepatitisz-A-vírus IgM antitestek (rövidítve: anti-HAV-IgM) meghatározására szolgáló összehasonlító kísérletben vizsgáljuk. 20 mintából álló HF-pozitív szérumsorozatot — melyek közül néhány anti-hepatitisz-A-vírus IgM antitesteket (rövidítve: anti-HAV-IgG) is tartalmazott — vizsgálunk meg az I. példa E. részében ismertetett módon, azonban azzal a különbséggel, hogy az ott említett torma-peroxidázzal jelzett anti-HAV-F(ab1)2 konjugát mellett tormaperoxidázzal jelzett anti-HAV-össz lg konjugátot, továbbá torma-peroxidázzal jelzett anti-HAVIgX konjugátot is alkalmazunk párhuzamos kísérletekben. Az utóbbi két konjugátot a tormaperoxidázzal jelzett anti-HAV-F(ab1)2 előállítására az (I. példa D. részében leírt módszerrel analóg módon állítjuk elő. A találmány szerinti, torma-peroxidázzal jelzett anti-HAV-F(ab1)2 konjugát alkalmazása mellett végrehajtott kísérletsorozatban nem volt kimutatható IgM antitest. A torma-peroxidázzal jelzett anti-HAV-össz lg és anti-HAV-IgG konjugátok számos esetben hamis pozitív eredményt adnak. A továbbiakban az RF pozitív szérumok lg frakcióiból az IgG és IgM frakciókat gradienscentrifugálással elkülönítettük és ezeket a frakciókat, külön-külön anti-HAV-enzim immunovizsgálat (olyan immunovizsgálat, amelynél az enzimet alkalmazzuk a hepatitisz A vírus elleni antitestek meghatározására) alapján megvizsgáltuk. Megerősíthettük, hogy anti-HAV IgM antitestek nem voltak jelen. Az eredményeket az alábbi táblázatban szemléltetjük. A mintát az esetben minősítettük pozitívnak, ha a szubsztrát hozzáadása után a 492 nm-nél mért abszorpció nagyobb, mint a negatív kontroll 2,,1-szeres ab-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
