182442. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunoglobulinok meghatározására
5 182 442 6 Bár az RF-t lehetséges az inszolubilizált anti-IgX-szel megkötni, és ennek az anti-IgX- nek inszolubilizált antigénmegkötő fragmensével közvetlenül, vagy közvetve is megköthetjük, de az antitest jelzett antigénmegkötő fragmense RF-fel nem működik. Ily módon az RF-nek tulajdonítható hamis pozitív reakciók elkerülhetőek. Az antigénnel végzett inkubálás és a jelzett antitesttel végzett kövekező inkubálás egy lépésben is megtörténhet úgy, hogy reagensként egy előzőleg jelzett antigént használunk, és a jelzést ennek az antigénnek a jelzett antitest fragmenséhez történő kapcsolásával végezzük. Ez a reagens új, és éppen ezért a találmány ezekre az új reagensekre is vonatkozik, amelyek tartalmazzák az antigén kapcsolási termékét ugyanezen antigén elleni antitestnek jelzett antigénmegkötő részével. Ennek az új reagensnek a felhasználásánál az antigén intenzív tisztítása nem szükséges, amely lényeges előnyt jelent. Amint a fentiekben is megállapítottuk, a találmány szerinti eljárás négy IgX osztály valamelyikéhez tartozó antigénspecifikus immunoglobulin kvalitatív és kvantitatív meghatározására alkalmas, anélkül, hogy a reumatoid faktornak tulajdonítható hamis reakció lejátszódna. Szilárd hordozó, amelyre az anti-IgX-et vagy ennek az anti-IgX-nek antigénmegkötő fragmensét kapcsoljuk, bármely vízoldhatatlan szilárd hordozó lehet, ha a kapcsolás kovalens kötésekkel vagy adszorpcióval elvégezhető. A szilárd hordozó lehet szemcse vagy különböző alakú és méretű lemezke, sőt cső vagy mikro-titráló lemez, amelyben az dmmunokémiai reakció történik és ahol az anti-IgX komponenst a reakcióedényeknek a belső falához kapcsoljuk. Az antitestnek antigénmegkötő fragmensét, amely a felhasználandó antigénre affinitást mutat, jelezhetjük enzimmel vagy fluorescens-, kromofor- vagy radioaktív csoportokkal, illetve atomokkal. Előnyösen az enzimmel történő jelzést használjuk. Ezek az enzimek'a következő típusokat foglalják magukba: kataláz, peroxidáz, ureáz, glükoz-oxidáz és foszfatáz, de egyéb enzimek is használhatók. Az immunokémiai reakció ismeretében egy enzám-szubsztrátot adunk a nyert reakciókeverék folyékony és/vagy szilárd fázisához, majd az enzim meghatározását elvégezzük például kolorimetrikus, fluorometríkus vagy spektrofotometrikus módszer segítségével. A találmány reagens-csomagra is vonatkozik, amelyeket az eljárás szerinti meghatározásokhoz használunk. A reagens-csomag főleg az alábbi komponensekből áll: a.) Meghatározott mennyiségű inszolubilizált anti-IgX-nek antigénmegkötő fragmense b. ) Meghatározott mennyiségű antigén, amely ellen a meghatározandó IgX irányul c. ) a b.) pont alatt leírt antigén elleni antitest jelzett antigénmegkötő fragmensének bizonyos mennyisége. A c.) pontban említett jelzett antitest fragmens jelzése enzimmel is történhet. Bizonyos esetben a reagens-csomag az alkalmazott enzim mennyiségének a meghatározásához szubsztrátumot is alkalmazhat. A b.) és c.) külön komponensek helyett a reagens-csomag tartalmazhat egyetlen reagenst is, nevezétesen az antigén kapcsolási termékét ugyanezen antigén elleni antitestnek a jelzett fragmensével. A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg: I. példa Hepatitisz A vírus/antigén elleni IgM antitestek meghatározása. A. Állati anti-human IgM készítése A nyúl anti-human IgM-t R. Gispen, I. Nagel, B. Brand-Saathof és S. de Graaf által leírt módszer szerint készítettük (Clin. Exp. Immunoi. 22, 1975, 431—437). Az anti-IgM specifikusságát anti-IgM szérum abszorbeáltatásával növeltük — emberi köldökzsinór-szérum alkalmazásával — az anti-IgG eltávolítása mellett. 0,05 ml emberi köldökzsinór-szérumot adtunk 0,2 ml anti-IgM szérumhoz, és a keveréket 1 órán át 37 °C-on inkubáltuk. Ezt követően 20 percig 14 000 g értéknél centrifugáltuk. A szupernaitánst 4 °C-on tartottuk. B. A hepatitisz A vírusfantigén készítése 20 %-os kivonatot készítettünk hepatitisz A-t tartalmazó székletmintából. 1 g székletet 4 ml 0,005 mólos foszfátpufferrel (pH — — 7,2) és 4 ml kloroformmal összekevertük, és az egészet 5 percig erélyesen ráztuk. Ezután a szuszpenziót 3000 g értéknél 30 percig 4 °C-on centrifugáltuk. A vizes fázist kipipettáztuk, és —20 °C-on tartottuk. Szükséges esetben a 20 %-os kivonat bizonyos mennyiségét foszfátpufferben úgy hígítottuk, hogy az extinkció kb. 1,00 legyen a hígított extraktumban, amelyet W. Duermeyer, I. v. d. Venn és B. Kosfer (Lancet 1978, I, 823) által leírt hepatitisz A antigén-meghatározás szerint szendvics enzim-iimmuno vizsgálathoz felhasználtunk. C. Hepatitisz A elleni IgG F(ab’)2-fragmensek készítése Az IgG-t hepatitisz A-val fertőzött beteg teljes szérumából izoláltuk DEAE-Sephandex-en, 0,0175 mólos foszfátpufferben (pH = 6,3) végzett frakcionálással. Az IgG Walpole-féle aoetát-pufferben (nátrium-aeetát 0,1 mólos vizes oldata, amelynek pH- ja ecetsavval 4,3-re van beállítva) levő oldatát (1 %—3 %) 37 °C-ra előmelegítettük, mintegy 20 órán át. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
