181994. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inaktivált peritonítisz vakcina előállítására
7 181994 8 A vírust azután hasonló módon 9 passzázson visszük keresztül, amikoris már kezdenek megjelenni kis felületeken a citopátiás hatás jellegzetes tünetei, vagyis a megfertőzött sejtek szabálytalan alakokat mutatnak, majd végül kikerekednek, ami a nedves készítmények mikroszkópos vizsgálata útján állapítható meg. Az ötödik passzázstól kezdődően a citopátiás hatás igen feltűnő már és igen gyorsan, 48—72 órán beiül a sejtréteg szétroncsolódására vezet. b) Inaktiválás A 6. passzázs után a fertőzött sejteket megfagyasztjuk és újból felengedjük; az így kapott szuszpenzió vírustitere 109’0 TCID50/ml. Az így kapott szuszpenzió alikvot-részéhez (100 ml) hozzáadunk 0,4 ml 40%-os formaldehidet, majd mágneses keverővei 4 °C hőmérsékleten 96 óra hosszat keverjük az elegyet ; ez alatt a vírus teljesen inaktiválódik. Az inaktivált-vírus készítményhez egy 32%-os nátrium-metabiszulfittörzsoldat 1 : 16 arányú hígításának 2 ml mennyiségét adjuk a formaldehid semlegesítése céljából. Ezután a vírus-készítményt éjjelen át dializáljuk Sörensen-féle foszfáttal pufferezett nátrium-klorid-oldatban, hogy a biztonsági vizsgálat céljaira eltávolítsuk a készítményből a nátrium-metabiszulfitot. c) Ellenőrző vizsgálat 1. Sterilitási próba Az inaktivált vírus-készítmény 5 ml-es alikvot-részeit 300 ml tápanyag-főzethez, illetőleg 300 ml húsfőzethez adtuk és 32 °C hőmérsékleten 7 napig inkubáltattuk, majd további 7 napig 18—20 °C hőmérsékleten folytattuk az inkubálást. Ez idő alatt egyik tápközegen sem tapasztaltunk mikroorganizmus-fejlődést, ami azt mutatta, hogy a készítmény mentes volt mikrobiológiai szennyezésektől. 2. Biztonsági próba Diploid maeska-embrió-tüdősejteket a vírus-készítménnyel fertőztünk és 37 °C hőmérsékleten inkubáltattuk a fertőzött sejt-készítményt. 7 nap múlva a sejteket verzenizáltuk és átoltottunk, majd további 7 napig ismét 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. 72, illetőleg 96 óra elteltével vizsgálva a készítményt, nem tapasztaltunk citopátiás hatást, ami azt bizonyítja, hogy a vírus nem szaporodott. 2. példa 3—4 hónapos, fertőző hashártyagyulladásban elhullott macskák peritoneális folyadékát pipettával, aszeptikus körülmények között eltávolítjuk és átoltjuk egy olyan sejtkészítményre, amely teljes diploid macskaembrió-sejtek összefolyó egysejt-rétegeit tartalmazza, szérummentes „199” közegben; a beoltott készítményt 37 °C hőmérsékleten 7 napig inkubáltatjuk. Ezután a vírust összegyűjtjük és az I. példában leírt módon sorozatos passzázsokon visszük át és inaktiváljuk a készítményt. 3. példa Egy fertőző hashártyagyulladásban elhullott 11 hónapos macska máját kivesszük és a máj-szövetet egy „Stomacher 80 (Colworth)” szövet-dezintegrátorban 60 másodpercig trituráljuk foszfáttal pufferezett nátrium-klorid-oldattal. A kapott szuszpenziót ezután 1108 g-vel centrifugáljuk, majd a szupernatáns folyadékot dekantáljuk és ráoltjuk egy heteroploid macskaembrió-tüdősejtek összefolyó egysejt-rétegét szérummentes „199” közegben tartalmazó sejt-készítményre. A készítményt egy 37 °C hőmérsékleten 7 napig inkubáltatjuk. (A heteroploid sejtek olyan sejtek, amelyeket 70-nél többször vittünk át sorozatos passzázsokon egy primer kultúrából és amelyek ezáltal egy meghatározott sejtvonallá alakultak.) A vírust ezután összegyűjtjük és az 1. példában leírt módon sorozatos passzázsokon visszük keresztül és inaktiváljuk. 4. példa A macskák fertőző hashártyagyulladása elleni vakcina előállítása Az 1. példában leírt eljárással egy olyan inaktivált vírus-készítményt állítunk elő, amelynek az inaktiválás előtti titer-értéke 109,0 TCID50/ml. Az 1. példában leírt vizsgálatok végrehajtása után a vírus-készítmény egyenlő térfogatú mintáihoz alumínium-hidroxid-gélt és foszfáttal pufferezett sóoldatot keverünk, majd az elegyet mágneses keverővei, a legnagyobb fordulatszámmal 1 óra hosszat keverjük. 5. példa A 4. példában leírt eljárással előállított vakcinát olyan 12 hetes macskáknak adjuk be, amelyek az előzetes vizsgálat során a fertőző hashártyagyulladás antitestjeitől menteseknek bizonyultak. A beadást intraperitoneális injekcióval végezzük, 2 ml-es adagokban. 21 nap múlva a vakcina további 2—2 ml adagját adjuk be intraperitoneális úton a macskáknak, ez alkalommal a macskáktól vért is veszünk és a vérszérumot megvizsgáljuk, hogy nem tartalmaz-e semlegesítő FIP-antitesteket. További 21 nap múlva ismét vérmintát veszünk a macskáktól; ez alkalommal azt tapasztaljuk, hogy szignifikáns mennyiségben vannak jelen semlegesítő antitestek. E kísérletek eredményeit az alábbi számértékek szemléltetik : vakcinálás előtti antitest-títer : kisebb mint 10, antítest-titer 21 nappal az első injekció után : 40, antitesttiter 21 nappal a 2. injekció után : 80. 6. példa A macskaféle állatok fertőző hashártyagyulladás és fertőző bélgyulladás elleni immunizálására alkalmas vakcina-készítmény a következő alkotórészekből áll: egy ampulla élő legyengített fertőző bélgyulladás elleni vakcina liofilizált állapotban, egy második ampulla, amely a 4. példában leírt módon készített inaktivált 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
