181965. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, szubsztituált prolin-származékok előállítására

33

181965

34

gátlásához szükséges, spektrofotometriai módszerrel meghatározva. Ezt az értéket úgy kaptuk, hogy ábrázoltuk a 0,001 fig/ml-től 1000 p.g/ml-ig terjedő tartományban 2—3-szorosan növekvő inhibitor koncentrációkkal kapott %-os gátlást. A százalékos gátlást a következő képlettel számítottuk ki :

Gátlás, °/0 =

(A — A°)

A a hippursav abszorpciója 30 perces kísérletben inhibitor nélkül ;

A° háttér abszorpció 0 időpontban ;

B a hippursav abszorpciója 30 perces kísérletben a megfelelő vizsgált inhibitor koncentráció mellett ;

B° háttér abszorpció inhibitor jelenlétében, de a 0 időpontban.

Tengerimalac csípőbéllet az angiotenzin I-et átalakító enzimet (ACE) gátló hatás in vitro vizsgálata

Ezt a módszert annak megállapítására használtuk, hogy a tengerimalac csípőbél angiotenzin I-gyel kiváltott összehúzódásokra gyakorolt hatás alapján egy vegyület az angiotenzin I-et átalakító enzim inhibitoraként tekinthető-e. Az ACE inhibitorok jellegzetesen gátolják az angiotenzin I okozta összehúzódásokat.

300—400 g-os, mindkét nembeli, kábított tengerimalacokat (Hartley törzs) fejükre mért ütéssel megöltünk. Csípőbelüket eltávolítottuk, és Vane módszerével (1) 2—3 cm-es csíkokká kikészítettük. Mindegyik bélcsíkot 10 ml Krebs oldattal (2) töltött fürdőbe helyeztünk 37 °C-on 95% oxigén és 5% széndioxid átbuborékoltatása mellett. Az izomaktivitást izotonikusan 1 g terheléssel mértük szív-simaizom transducer (Harvard 356) segítségével, amelyet dinográfhoz kapcsoltunk (Beckmann R típus).

Miután a szöveteket 90 perc alatt egyensúlyba hoztuk, 10 perces időközökben 2 perces jeleket mértünk a következő aganistával :

angiotenzin I (A—I) 0,025 mcg/ml végső fürdő koncentráció.

Az A—T-nek ezzel a koncentrációjával kiváltott összehúzódások a maximum 50—75%-ának felelnek meg.

5 A vizsgálandó vegyületet általában vízben vagy nálriumklorid oldatban oldottuk, és vízzel 10-szeresre hígítottuk. Az agonistát 2 percig előkezeltük a vizsgálandó ■együlettel, és az összehúzódások változásának százalékos értékét regisztráltuk. A hatásos vegyüleíek, azaz 10 amelyek ACE inhibitorként számításba jöhetnek, jellegzetesen gátolták az angiotenzin 1 által kiváltott összehúzódást.

Az EC50 értéket, amelyet íC50-kénl is említenek (a vizsgált vegyületnek az a koncentrációja, amely az A—I 15 összehúzó hatását 50%-osan gátolja), grafikusan és bionetrikusan becsültük meg; a vizsgált vegyületet legilább néhány koncentrációban vizsgáltuk, hogy megszerkesszük a koncentráció-gátló hatás görbét.

A vizsgálati módszerek a következő közlemények ada- 20 i.ain alapultak :

;i) Vane, J. R. : Brit. J. Pharmacol. 23, 360, 1964;

(2) HANDSCHUMACHER, R. C, Vane, J. R.; Brit. J. Pharmacol. 29, 105, 1967.

(3) Rubin, B., O’Keefe, E., Kotier, D. G., DeMaio D. 25 A. és Cushman, D. W. ; Fed. Proc. 34, 770, 1975 ;

(4) O'Keefe, E. H., D. G. Koder, Waugh, M. H., Rubin, B.; Fed. Proc. 31, 511, 1972;

(5) Rubin, B., Laffan, R. J., Kotier, D. G., O Keefe, E. H., DeMaio, D. A., Goldberg, M. E.; J. Phar-30 macol. Exper. Therap. 204, 271, 1978.

A százalékos gátlás meghatározásának képlete;

A-B---------.100

A

35 A összehúzódás (mm) A—T hatására hatóanyag nélkül B összehúzódás (mm) A—I hatására hatóanyaggal.

A következő táblázatban ismertetjük a találmány szerinti T általános képletű vegyületek néhány jellegzetes képviselőjével meghatározott adatokat (R2 hidrogén- 40 atom).

R

Rí

r4

Rj

n I50 (f4g/ml)

ECso

(fxg/ml)

—OH

H

H

0

0,19

■ 0,036

—OH

—CHj (DL)

—

H

0

0,23

0,064

—OH-CH3 (L)

—

H

0

0,035

0,0029

—OH

H

H

H

1

0,05

0,022

—OH

H

H

OH

1

0,21

0,056

—OH-CH3 (D)

H

H

1

0,005

0,008

—OH-CH3 (L)

H

H

1

0,52

1,7

—nh2-ch3 (D)

H

H

1

0,18

0,26

—OH

—Bz (DL)

H

H

i

0,018

0,113

—OH

CH3 (DL)

H---------OH

1

0,011

0,007

—OH-CH3 (D)

H

—OH

i

0,002

0,0017

—OH

H

H

H

2

2,1

2,7

—OH

H

—CH3

(DL)

H

1

0,23

0,5

—OH

—Ph (DL)

H

H

1

0,56

0,4

—OH

H

H

H

1

0,18

0,56

—OC(CH3)3-CH3 (D)

H

H

1

2,9

—

—OH-Ad-CH3 (D)

H

H

1

0,009

0,0015

—OH-c2h5 (L)

H

H

1

0,06

0,046

—OH-c2h5 (D)

H

H

1

0,004

0,006

17