181965. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, szubsztituált prolin-származékok előállítására
31 181965 32 A hatóanyagot, a konzerváiószereket cs a nálrium-kloridot feloldjuk 3 liter injekciós minőségű vízben, és utána feltöltjük az oldatot 5 literre. Az oldatot steril szűrön megszűrjük, és aszeptikusán előre sterilezett fiolákba töltjük, amelyeket utána előre sterilezett gumikupakokkal lezárunk. Mindenegyes fiola 5 ml oldatot tartalmaz, amelyben az injekciós oldatban milliliterenként 100 mg hatóanyag van. 64. példa Az 59. példában az l-(2-merkapto-propioniI)-L-prolint 100 g l,l'-[ditio-bisz(2-D-metil-3-propionil)]-bisz-L-prolinnal helyettesítve 1000 darab egyenként 100 mg l,l'-[dítio-bisz(2-D-metil-3-propionil)]-bisz-L-prolint tartalmazó tablettát készítünk. Farmakológiai vizsgálatok Az emberi szervezetben a vérnyomást befolyásoló — növelő — egyik tényező a renin-angíotenzin-aldoszteron rendszer. A renin enzim a vese kéregállományban levő érgomolyagok melletti izomfelülct sejtjeiben termelődik, és innen szabadul fel. A renin kiválasztását szabályozó mechanizmusra valószínűleg elsősorban a vér só- és víztartalma, valamint a vesén átáramló vér nyomása hat. Ha ezek a tényezők gyengülnek, a renin közvetlenül a vérbe jut. Itt összetalálkozik szubsztrátumként egy a2-g1obulinnal, az angiotenzinogénnel (aktív fehérje). A renin az angiotenzinogént két, azonosan inaktív komponenssé hasítja, egy tetrapeptiddé és angiotenzin I elnevezésű (A—1) dekapeptiddé. A kapilláris erekben keringve (elsősorban a tüdőben) az A—I a kapillárisok laphám sejtjeiben levő angiotenzint átalakító enzimmel (ACE) lép kapcsolatba. Az ACE az A—I-et egy dipeptiddé és az emberi testben a leginkább vérnyomást fokozó anyagként ismert oktapeptiddé, angiotenzin If-vé (A—II) hasítja. Az A—II vérnyomást növelő hatása helyileg az izomzatban, valamint központilag is jelentkezik ; az A—II-vel való ingerlés hatására az agy a szervezet egészére kiterjedő, vérnyomás növekedést előidéző ingereket továbbít. Ezen felül az A—II másik hatást is kivált, nevezetesen a mellékvesekéreg aldosteron — mineralkortikoid — kiválasztását fiziológiailag ingerli. Az aldosteron növeli a vesecsatornából a nátriumionok felszívódását, így a vérmennyiség növekszik, és a vérnyomás ezen második mechanizmus alapján fokozódik. Az A—I-nek A—Il-vé való átalakításán kívül az ACE-nek további szerepe is van. Az ACE az értágító hatású bradikinint inaktív komponensekké alakítja. Ilyen funkciója szempontjából az ACE-t kinináz Il-ként is számontartják. A magas vérnyomásban szenvedő egyénben a renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer zavart és ez meghatározóan magas vérnyomást idéz elő. Az ACE-t gátló gyógyszer a következő hatásokat képes kiváltani: 1. Az A—II képződését gátolja, és így (a) közvetlenül gátolja az érösszehúzódás!, cs (b) a mellékvesekéregből gátolja az aldoszteron kiválasztást (azaz a víz és sófelesleg kiválasztását). 2. Az ACE gátlása alapján a bradikinin bomlása akadályozott, így értágító hatása (vérnyomást csökkentő) fennmarad. A jelenleg forgalomban levő, vérnyomást csökkentő szerek egyike sem gátolja az ACE működését. A találmány szerinti I általános képletű prolinszármazékok erős ACE-gátlók. Gátolják az angiotenzin I dekapeptid átalakulását angiotenzin Il-vé, és így csökkentik vagy megszüntetik az angiotenzin II kiváltotta magas vérnyomást. A találmány szerinti vegyületek beavatkoznak az angiotenzinogén (renin)-angiotenzin I — angiotenzin II átalakulási folyamatba az ACE hatástalanítása útján, és így csökkentik vagy megakadályozzák az angiotenzin 11 képződését, amely felelős a vérnyomás növekedésért. Az I általános képletű vegyületek hatásának kifejtése teljesen eltérő a szokásosan használt, magas vérnyomás elleni gyógyszerektől. A találmány szerinti vegyületek lehetővé teszik a magas vérnyomást kiváltó tényezőkbe való közvetlen beavatkozást, az eddigi szerek tüneti kezelésre irányuló jellege helyett. Az I általános képletű vegyületek gyógyászati hasznossága tehát az angiotenzint átalakító enzim hatásának megakadályozásán alapul. A gátló hatást in vitro a nyúltüdőből kivont angiotenzin átalakító enzimre kifejtett hatás és a tengerimalac csípőbél angiotenzin I által okozott összehúzódására gyakorolt hatás alapján határoztuk meg. Ezek a szakterületen ismert vizsgálati módszerek. Nyúltüdőből izolált, angiotenzint átalakító enzimre kifejteti gátlás Nyúltüdőből származó sejtmentes kivonat angiotenzint átalakító enzimjének hatékonyságát a hippuril-L-hisztidil-L-leucinból (HHL) az enzim hatására felszabaduló hippursav spektrofotometriai meghatározásával mértük Cushman és Cheung módszere szerint [Biochem. Pharmacol. 20, 1637 (1971)]. C6H4—Gly—His—Leu -C6H4—Gly -f His—Leu. Ebben a spektrofotometriai vizsgálatban az angiotenzint átalakító enzim gátlásának méréséhez a következő összetételű közeget alkalmaztuk 37 °C-on 0,25 ml menynyiségben : 100 mmol foszfát-puffer (pH 8,3) 300 mmol nátrium-klorid 0,001—1000 |J.g/ml inhibitor (vagy inhibitor nélkül) 5—10 m egység enzim. A fenti összetételű közeget 30 percig különböző inhibitor koncentrációkkal vagy inhibitor nélkül inkubáltuk, és az enzimreakciót 0,25 ml n sósavval megállítottuk. Kontrollvizsgálatot is végeztünk úgy, hogy az enzimet azonnal (0 időpontban) inaktiváltuk sósavval az enzim hozzáadása előtt. Az enzim hatására felszabadult hippursavat 1,5 ml etilacetáttal extraháltuk, 20 másodperces erőteljes keverés és az etilacetátos rétegnek centrifugálással való elválasztása után az oldószer 1,0 ml-nyi alikvot részét elkülönítettük és 100 °C-on szárazra bepároltuk, a hippursavat 1,0 ml vízben oldottuk és 228 nm-nél abszorpciója alapján mennyiségileg meghatároztuk. Az angiotenzint átalakító enzim inhibitor hatékonyságát T50 értékben fejezzük ki, azaz azt az inhibitor mennyiséget adjuk meg pg/ml-ben vagy pmolban, amely az angiotenzint átalakító enzim hatásának 50%-os 5 IC 15 2C 25 3C 35 4( 45 5C 55 6C 65 16
