181930. lajstromszámú szabadalom • Eljárás májsejtek szaporodását stimuláló faktor előállítására
131930 ban leölt kísérleti állatok máját homogenizáljuk, pH-ját 5,5- re beállítjuk, 95 °C-on hőhatással denaturáljuk és centrifugálással a faktort tartalmazó felülúszót elválasztjuk, vagy b) részleges májeltávolításnak alávetett kísérleti állatok vagy embrionális vagy néhány hetes korukban leölt kísérleti állatok vérplazmájának pH-ját 5,5-re beállítjuk, 95 °C-on hőhatással denaturáljuk, centrifugálással a felülúszót elválasztjuk és neuraminidázzal kezeljük. A májsejtek szaporodását stimuláló faktor orvosilag széles körben felhasználható. A faktor elvileg valamennyi olyan betegség kezelésére alkalmas, amelyeknél a májsejtek bármely okból betegek, és az új egészséges májsejtek szaporodása megfelelő terápiát jelent (hepatitis, májzsugorodás). Emellett igen nagy előnyt jelent, hogy a találmány szerinti anyag, bár szervspecifikus (vagyis csak a májsejtek szaporodását stimulálja, a vese- vagy lépsejtekét például nem), mégsem fajspecifikus, úgyhogy többek között egy bizonyos faj (patkány) májából, a máj egy részének eltávolítása után kivont anyagok más fajokra is hatásosak, ami egereknél bizonyítható is volt. A faktorra a tudományos nómenklatúra szokásos képzését alapul véve (például eritropoetin) a „hepatopoetin” név kínálkozott. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal szemléltetjük. 3 1. példa A kísérleteket 95—105 g súlyú nőstény SPF-Wistarpatkányokkal (Institut für Strahlen- und Umweltforschung, Neuherberg/München) végeztük. Az állatok a kezelés előtt és után táplálékul vizet kaptak, és az „Altromin” kereskedelmi néven kapható készítményt tetszés szerinti mennyiségben. Valamennyi állat májának 68%-át kivettük, tehát a máj egy részét eltávolítottuk, éspedig a májsejtek szaporodási aktivitását a nap múlásával tekintetbe véve, normál patkányoknál este 19—21 óra között. A máj részleges eltávolításá t Higgins és Anderson [Arch. Path. (Chicago) 12, 186 (1931)] módszerével végeztük. Az állatok mindig 12 órával a máj részleges eltávolítása után öltük le. Az állatokat könnyű narkózisban kivéreztettük, és a májuk maradékát kivettük, ez előtt azonban az állatok máját a kapuérből (vena portae) 0,9%-os nátriumklorid-oldattal átöblítettük. 3—3 állat maradék-máját négyszeres mennyiségű (súly/súly) kétszer desztillált vízzel Elvehjem-edényben homogenizáltuk. Ennek során a májsejteket aprítottuk, és lehetőség szerint teljesen elroncsoltuk. A májsejteket egy üveghengerbe tettük, és azok a henger és egy benne forgó tefloncsap között a nyíróerő hatására felnyíltak, illetve szétroncsolódtak. így sikerült biztosítani, hogy a sejtekben lévő anyagok az ezt követő koncentráláshoz, illetve izoláláshoz rendelkezésre álljanak. Ezeknek a májsejthomogenizátumoknak a pH-értékét 0,1 n sósavval 5,5-re beállítottuk. Ez a savanyítás igen lényeges a szelektálás szempontjából, mivel így a proteinek egy nagy része kiválik. Azzal, hogy a proteineket ily módon kicsapjuk, ezeket a további koncentrálási, illetve izolálási eljárásból kivonjuk. Ezután a májhomogenizátumokat 20 percig 95 'C-on hőhatással denaturáljuk. Ennek az a cé’ja, hogy kicsapjuk a homogenizátum további olyan alkotórészeit, amelyek ezen a hőmérsékleten és ennél a pH-értéknél nem stabilak. Ezekkel az eljárási műveletekkel, vagyis az 5,5 pH-értékre végzett savanyítással és a hőhatással végzett denaturálással tehát a májsejtek alkotórészeinek nagy hányadát eltávolítottuk. Ezután a homogenizátumot 15 percig (4000 g, Minifuge Christ, Osterrode/Harz) centrifugáltuk. A centrifugálás után kapott felülúszó rész így csupán azokat, az eredetileg a ho- 5 mogenizátumban lévő hatóanyagokat tartalmazza, amelyek 5.5 pH-értéken és 95 °C-on stabilak, ezeket azonban tiszta állapotban. Abból a célból, hogy ennek a hatóanyagnak még azokat a részeit is kitermeljük, amelyeket esetleg a centrifugálás során kapott csapadékok tartalmaznak, a csapadéko-10 kát kétszer desztillált vízzel az eredeti térfogatra ismét feltöltöttük, 5,5 pH-értékre újra megsavanyitottuk, hővel újra denaturáltuk és centrifugáltuk. Ezt összesen kétszer megismételtük. Az összesen három centrifugálási műveletből kapott felül- 15 úszó részeket egyesítettük, és liofilizáltuk, vagyis vákuumban vízelvonással fagyasztva szárítottuk úgy, hogy ezeket porított formában kaptuk meg. A terméket a további felhasználásig -20 °C-on tároltuk. Ez az anyag a részleges májeltávolításnak alávetett kísérleti állatok maradék-májá- 20 nak extraktuma (TL-extraktum). Ugyanakkor, amikor a májuktól részben megfosztott állatokat, leöltük a kontrollállatokat is, amelyeknél részleges májeltávolítást nem végeztünk. Ez utóbbiak teljes máját kivettük, miután a májukat 0,9% nátriumklorid-oldattal 25 átöblítettük. A kontrollállatok májának egy részét, amely a kísérleti állatok maradék-májával egyenlő mennyiségű volt, ugyanúgy kezeltük, mint a kísérleti állatok maradék-máját, vagyis a májukat először 95 °C-on hőhatással denaturáltuk, 5.5 pH-értékre beállítottuk, végül centrifugáltuk, s emellett 30 a két utolsó műveletet mindegyik csapadékkal kétszer megismételtük. A felülúszó részeket ugyancsak liofilizáltuk, ez a normális májjal rendelkező állatokból kapott extraktum (NL-extraktum). A kísérleti állatok maradék-májának kezelésével kapott 35 felülúszó részek, vagyis a TL-extraktumok tartalmazzák a májsejtek szaporodását stimuláló faktort, a hepatopoetint. Ezt a következőképpen bizonyítottuk: a TL-extraktumot 0,9%-os nátriumklorid-oldatban feloldottuk. Az oldat 2 ml mennyiségét i.p. injekcióban beadtuk 40 normál patkányoknak. A kontrollállatoknak injekcióban ugyancsak beadtuk a részleges májeltávolításnak alá nem vetett normál állatokból kivont NL-extraktumok azonos mennyiségét. További kontrollállatoknak i.p. injekcióban 0,9%-os nátriumklorid-oldatot adtunk. 45 A TL-extraktumok beinjekciózása után a májsejtek szaporodását a DNS-szintézis mérésével határoztuk meg. Ezt úgy végeztük, hogy a DNS-ba specifikusan beépített radioaktív anyagot, a 3H-metil-timidint mértük (specifikus aktivitás 25 Ci/mmól; Radiochem, Center, Amersham). 50 A kísérleti állatoknak és a kontrollállatoknak 19 órával a TL-extraktum, illetve az NL-extraktum beadása után 50 pCi 3H-metil-timidint adtunk injekcióban. 1 óra múlva az állatokat leöltük, a májukat kivettük, és -20 °C-on tároltuk. Ezután a májból a DNS-at Weinbren, K. és Woodward, 55 E. módszerével [Br, J. exp. Path. 45,442—449 (1964)] extraháltuk. Ennek az extraktumnak egy részét radioaktív méréshez használtuk fel. Erre a célra 1,5 ml perklórecetsav-tartalmú oldatot 0,5 ml 1 n nátriumhidroxiddal semlegesítettünk. Az így kapott oldathoz szcintillációs üvegben 5 ml polioxi- 60 etilénéter-keverékből (Triton XI00) és 10 ml toluolból álló, 0,6% 1,5-difeniloxazolt tartalmazó elegyet adtunk. Folyadék-szcintillációs-számlálóval (Intertechnik, Paris) a percenkénti bomlások számából (Zpm) megállapítottuk a radioaktivitást. A DNS-extraktum egy másik részét Burton eljárásá- 65 val [Biochem. J., 62, 315—323 (1956)] mérve, a DNS-4 / / 2
