181930. lajstromszámú szabadalom • Eljárás májsejtek szaporodását stimuláló faktor előállítására
181930 koncentráció meghatározására használtuk fel. A DNS-szintézis mértéke tehát a specifikus aktivitás: Zpm/gg DNS/g máj. Az NL-extraktumma! injekciózott normál patkányok az említett kísérleti körülmények között átlagosan 3340 ± 1320 Zpm/pg DNS/g máj közepes specifikus aktivitást mutattak (a kísérleti állatok száma: n = 8). A fiziológiás konyhasóoldattal injekciózott normál patkányoknál ez az értéke 3470 ± 740 (n = 8). Az aktivitás tehát a kontrollállatok mindkét csoportjánál lényegében azonos volt. A TL-extraktummal injekciózott állatoknál ezzel ellentétben sokkal nagyobb, vagyis 11 240 ±4730 közepes specifikus aktivitás mutatkozott. Ez azt jelenti, hogy a kontrollállatokéhoz (NL-extraktum és NaCl) hasonlítva az aktivitás 3,3- szer nagyobb, mégpedig igen nagy statisztikai biztonsággal (p«0,01). Ez igazolja, hogy a részleges májeltávolításnak alávetett állatok maradék-májából a fenti módon kivont extraktumokat i.p. injekcióban beadva, normál állatoknál a DNS-szintézis jelentősen fokozódik, ami viszont a sejtosztódás és így a sejtosztódással történő májnövekedés szükséges előfeltétele. Annak megállapítására, hogy a DNS-szintézis bekövetkezett fokozódása valójában ennek megfelelően növeli a májsejtek számát, egyidejűleg mértük a májsejtek szaporodását, vagyis mitózis-számlálást végeztünk. Ehhez az NL-, illetve TL-extraktumok beinjekciózása után 24 órával a patkányokat kivéreztettük, és a májukat kivettük. A májak eltávolítása előtt azokat a vena portae-ból 0,9%-os nátriumkloridoldattal átöblítettük. A szövettani készítményt Pera [Histochem. 30, 82 (1972)] és Silz és társai [Acta Hepagastroenterol. 23, 255—261 (1976)] szerint készítettük. Ehhez a Lobus caudatus egy részét használtuk. 5 pm-es metszeteket készítettünk, és ezeket hematoxilin-eozinnal megfestettük. A mitózis mértékét 10 000 sejt/metszet megszámolásával határoztuk meg. A mitózis mértékének kiszámolásából azt kaptuk, hogy a TL-extraktum-injekció a májsejtek szaporodásának tényleges növekedéséhez is vezetett. A mítózis-index két meghatározásából 7, illetve 4 mitózis/104 sejt, ezzel ellentétben 0—2 mitózis/104 sejt normál patkányoknál. Ez az eredmény bizonyítja, hogy a maradék májsejtekből kivont extraktum i.p. injekcióban beadva, normál állatoknál a májsejtek szaporodásának növekedéséhez vezet. A TL-extraktumban lévő faktor kvalitatív meghatározását a következő kísérletekkel végeztük. 5 a) Enzimes kezelés aa) Tripszin-kimotripszin kezelést végeztünk. Ehhez a liofilizált felülűszórészeket 20 ml kétszer desztillált vízben feloldottuk, az oldat pH-értékét 7,6-re beállítottuk, és 30 °C-on 2 órán át 80 egység tripszinnel (legtisztább) és 90 egység a-kimotripszinnel (legtisztább, SERVA, Heidelberg) inkubáltuk, ezután 30 percig 95 °C-on inkubáltuk, majd centrifugáltuk. Az oldatot liofilizáltuk, és i.p. injekcióban kísérleti állatoknak (patkányoknak) 2 ml 0,9%-os nátriumkloridoldatban beadtuk. Ez az enzimes kezelés — amennyiben proteineknél vagy proteideknél végezzük — ezeket tipikus módon hidrolizálja, és így inaktiválja. Ez történt itt is: az enzimes inkubálás az aktivitást hatástalanította. A radioaktivitás ugyanis 3234 ± 1340-nek adódott (n=5). Ebből következik, hogy a faktor protein vagy proteid. bb) A továbbiakban neuraminidáz-kezelést végeztünk. Ehhez a liofilizált felülúszó részeket 20—20 ml kétszer desz(illáit vízben feloldottuk, az oldat pH-értékét 5,5-re beállítottuk, és 1 órán át 37 °C-on 250 egység neuraminidáz-alapanyaggal (Behring-Werke, Marburg) inkubáltuk. Ezt kövelően a feleslegben lévő neuraminidázt 95 'C-on 30 perc alatt inaktiváltuk, centrifugáltuk (15 perc, 3000 g), és az oldatot ismét liofilizáltuk. A liofilizátumot 2 ml 0,9%-os nátriumklorid-oldatban feloldottuk, és kísérleti állatoknak (patkányoknak) injekcióban beadtuk. Ez az enzimes kezelés — amenynyiben neuraminsav-tartalmú glikoproteinekről van szó — tipikus módon a neuraminsav lehasításához vezet, és így a proteineket inaktiválja. Ez az inaktiválás jelen esetben nem következett be. Inkább az bizonyosodott be, hogy a 3H- metil-timidin beépülési aktivitása a DNS-ba és az extrahált DNS ezáltal létrejött radioktivitása igen nagy volt, mint a kezelés előtt is. Ez az érték 13 900 ± 5650 (n = 3) volt. Ebből következik, hogy a részleges májeltávolításnak alávetett állafok májából a fent leírt módon extrakcióval kitermelt faktor nem olyan anyag, amely az aktivitáshoz jelentős neuraminsavat tartalmaz. 6 b) A molekulasúly meghatározása A meghatározáshoz a TL-extraktumot különböző pórusméretű molekulaszitákon (Amicon, Lexington, USA) nyomószűrésnek vetettük alá. A PM 30-as szűrőn szűrve az összes aktivitást a szűrőn maradt anyag mutatja. A PM 30-as szűrőn nyomószűréssel szűrve az extraktum fajlagos aktivitása kb. százszorosára növekedett, a kiindulási anyagéhoz viszonyítva. A molekulasúly tehát kb. 30 000 D (Daltón) felett van. A nyomószűrést XM 50 szűrőn végezve az aktivitásnak kb. felét a szűrlet, a másik felét a szűrőn maradt anyag mutatja. Ez azt bizonyítja, hogy a molekulasúly 30 000 és 50 000 D között van. A molekulasúly felső határa relatív nagy biztonsággal 50 000 D-nak vehető, de az alsó határa csak hozzávetőleges érték. 20 000 vagy 25 000 D molekulasúly is számításba vehető. A talált faktor aktivitása legalább részben szervspecifikus. A kontrollállatok (NL, illetve NaCl) májából kapott TL- extraktumokat beinjekciózva, radioaktív beépülés a lépvagy veseszövetekbe nem volt észrevehető. Másrészt bebizonyosodott, hogy a faktor nem fajspecifikus. TL-extraktumot NMRI-egerekbe (21—24 g, SPF, Institut für Strahlen- und Umweltforschung, Neuherberg, München) injekciózva az eredmény ugyanaz volt, mint a patkányoknál (TL: 12 050±6510; NL: 4350 ±530; NaCl: 3240 ± 1810; n = 5). 2. példa A kiindulási pont a következő megfontolás volt: a fenti kísérleteknél az i.p. injekciót a hasüregbe adtuk. A TL- extraktumnak tehát a vérkeringésen keresztül kellett a májba jutnia, így a vérkeringésben is jelen lehetett. Ezért a patxányokból, amelyeknek máját a fentiekkel azonos módon részben eltávolítottuk, azonos kísérleti körülmények között vérplazmát is vettünk, és ebből a maradék-májra leírtakkal azonos módon extraktumot állítottunk elő. Ha ezt az extraktumot, amit részleges májeltávolításnak alávetett állatok vérplazmájából készítettünk (PT extraktum), normál patkányokba injekcióztuk, úgy a májsejtek szaporodási fokának stimulálása nem észlelhető (3800 ±960, n = 5). Ha azonban egy ilyen PT-extraktumot neuraminidázzal 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
