181659. lajstromszámú szabadalom • Fémszol-részecskével jelzett immuno-vizsgálati módszer
19 181659 20 VII. példa A HCG meghatározása arany-részecske—anti-HCG konjugáttal agglutinációs tesztben 7.1. A reagensek készítése Az arany-szolt az 1.1. pontban leírt módszer szerint, a nyúl anti-HCG-t és annak immunoglobulin frakcióit a 6.2. pontban leírtak szerint készítettük. Az arany-részecske—anti-HCG konjugátumot az 1.4. pontban leírt módszerrel, arany-szol és nyúl anti- HCG oldat felhasználásával készítettünk. 7.2. Vizsgálati előirat 1. 1 ml arany-szol részecske—anti-HCG konjugátumot (ALomnm=l>50) egy kb. 3 ml-es csőbe pipettázunk. 2. Ahhoz a vizsgálandó vizelet 0,1 ml-ét pipettázzuk és összekeverjük. 3. Szobahőmérsékleten végzett egy órás inkubálás után a konjugát színét megbecsüljük. — ha a vörös szín elszíntelenedik, akkor a minta erősen pozitív, — ha a vörös szín bíborvörösre változik, a minta pozitív, és koncentrációja 1 IU HCG/ml vagy ennél magasabb, — ha a szín nem változik, a minta negatív, azaz koncentrációja 0,4 IU HCG/ml vagy ennél kevesebb. 7.3. Eredmények A 7.2. pontban leírt vizsgálati módszer segítségével az utolsó menstruációt követő 33—35. napon a terhesség megállapítható. VIII. példa HCG meghatározás kompetitiv receptor felhasználásával 8.1. Tisztított HCG receptor-protein készítése szarvasmarha corpoia luteából (BCL) BCL-ből HCG receptor-proteint úgy készítettünk, ahogy azt részletesen Khan és Saxena az „Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs” (szerkesztette: S. B. Pal, kiadó; Walter de Gruyter, Berlin, New York, 1978) c. könyv 257—275. oldalain leírták. A HCG receptor-protein így nyert diszperzióját PBS- ben pH=7,0 értéknél dializáltuk és 4 °C-on tároltuk. 8.2. Polisztirol mikroelemző lemezek HCG receptor-proteinnel történő bevonása E célból a HCG receptor -protein oldatot 25 fig protein/ml tartalommal készítjük oly módon, hogy a HCG receptor-proteint PBS-ben hígítjuk 7,4 pH-ra állított 0,04 mol/1 NajHPíLt, valamint 0,04 mol/1 NaH2P04 — melyhez 0,1 g/l Merthiolátot adtunk — oldatával. A mikroelemző lemezeket — az 1.5. pontban már leírt módszer szerint — a fenti HCG receptor-oldattal bevonjuk. 8.3. Az arany diszperzió készítése A 6 és 15 nm közötti átmérőjű részecskéket tartalmazó arany-szolt oly módon készítettük, hogy 14 ml, 10 g/l nátrium-citrát dihidrátot tartalmazó oldatot forrásban levő 100 mg/1 koncentrációjú hidrogén-[tetraklór-aurát(III)] oldathoz adtunk. A nyert narancssárgásvörös arany-diszperziót szobahőmérsékletre hűtöttük és a térfogatát ismét 500 ml-re egészítettük ki egy mérőlombikban. Az arany-diszperzió fényelnyelési maximuma 523 nm-nél volt és az Aj2TM m értéke 1,0. 8.4. Arany-részecske HCG konjugát készítése PBS-ben (pH=7,0) 5 mg/ml tisztított HCG-t tartalmazó oldatot dializáltunk 5 mmol/1 NaCl-t tartalmazó oldattal szemben, amelynek a pH-ját sósav segítségével 4,5-re állítottuk. A dializált HCG oldat 1 ml-ét az arany-diszperzió 500 ml-éhez adtuk és 10 percig szobahőmérsékleten kevertettük. Literenként 10 g Carbowax 20M jelzésű gyantát tartalmazó oldat 10 ml-ét a friss konjugátumhoz adtuk és további 10 percig inkubáltuk. Ezután a pH értékét KaC03 oldat segítségével 7,4-re állítottuk. A konjugátot 4 °C-on tároltuk. Közvetlenül a felhasználás előtt 1 g/l BSA-t tartalmazó 1 ml 1 mol/l TRIS/HCl/NaCl puffert (pH=7,4) adtunk a tárolt konjugát diszperzió 10 ml-éhez. 8.5. Kompetitiv HCG mérése, vizsgálati előirata 100 /il standard HCG oldatot (vagy a mintát) vittünk annak a mikroelemző lemeznek mélyedésébe, melyet HCG receptor-proteinnel vontunk be és egy órán át szobahőmérsékleten inkubáltunk. Ezután a pufferolt aranyrészecske HCG konjugát 100 fil-ét hozzáadtuk és 4 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. A mélyedéseket kiürítettük és 0,3 ml 0,01 mol/1 TRIS/HCl/NaCl pufferrel (melynek pH-ja 7,4) átmostuk. Végül 0,1 ml 0,1 mol/1 NaOH vizes oldatát adtuk hozzá és 10 percig inkubáltuk. A mélyedésben levő folyadék fényabszorpcióját 536 nm-nél spektrofotométerrel mértük. 8.6 Eredmények A szabad HCG mennyiség-dózis-válasz görbéjét 0 és 1000 mIU/ml közötti koncentrációjú HCG oldatra készítettük, amikoris az átlagos érték közel 100 mIU HCG./ml volt. Az érzékenységi küszöbérték kb. 10 mIU HCG/ml. A mintákban mért HCG koncentráció általában magasabb mint az EIA-val történő meghatározás esetén. IX példa Szendvics módszer a HCG meghatározásához inszolubilizált HCG receptor és arany részecske— ami-HCG konjugát segítségével Ezen módszernél a mikroelemző lemezeket a 8.2, pontban leírtak szerint HCG receptor-proteinnel vonjuk be. Az arany-részecske—anti-HCG konjugátot az 1.4. pontban leírtak szerint állítjuk elő, amikoris a nyúl anti-HPL helyett nyúl anti-HCG-t alkalmazunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
