181659. lajstromszámú szabadalom • Fémszol-részecskével jelzett immuno-vizsgálati módszer
21 181659 22 9.1. Vizsgálati leírás 0,1 ml standard HCG oldatot — amely 1 g/l BSA-t (vagy mintát) tartalmazó 7,4-es pH-jú 0,1 mol/1 TRIS/ HCl/NaCl pufferben van — pipettázunk a mikroelemzŐ lemez mélyedésébe, amelyet HCG receptor-proteinnel vontunk be és egy órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Azután a mélyedéseket kiürítjük és 0,1 ml aranyrészecske—anti-HCG konjugátot pipettázunk mindegyik mélyedésbe, majd egy éjen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. A mélyedéseket kiürítjük és hatszor átmossuk 0,3 ml 0,01 mol/1 TRIS/HCl/NaCl pufferrel (pH= =7,4). 0,1 ml 0,1 mol/l NaOH-t pipettázunk mindegyik mélyedésbe és 15 percig inkubáljuk. A mélyedések tartalmának fényabszorpcióját spektrofotométerrel meghatározzuk. 9.2. Vizsgálati eredmények A mennyiség-dózisválasz görbét 0 és 1000 mIU/ml közötti HCG koncentrációnál vettük fel. Az érzékenységi küszöb kb. 5 mIU/ml volt. A mintákban mért HCG koncentráció közel azonos volt az EIA-val mértekkel. X. példa PbS-szolt alkalmazó HCG-agglutinációs teszt 10.1. PbS-szol részecskék készítése PbS szolt oly módon készítünk, hogy egy 0,1 mmol/l Pb(N03)2-ot, 0,101 mol/1 etilén-dinitrilo-tetraecetsavas dinátrium-sót és 10 mmol/l (NH4)2C03-ot tartalmazó oldaton kénhidrogén gázt buborékoltatunk át 3 percig. A narancs színű tiszta szolt 60 000 N/kg értéken történő centrifugálással mossuk és a szupernatánst eldobjuk. 10.2. Az anti-HCG kapcsolása a PbS-részecskékhez A szol részecskéket újra diszpergáljuk 5 mmol/l NaCl-ot tartalmazó és 0,2 mol/l-es K2C03-oldat cseppenkénti adagolásával 8,5-es pH-értékre állított, továbbá a 6.2. pont szerint tisztított anti-HCG-t 1 mg/ml koncentrációban tartalmazó oldattal. A konjugátot háromszor kimossuk 60 000 N/kg értéken történő centrifugálással oly módon, hogy a szupernatánst mindig eldobjuk, a szemcsét pedig újra diszpergáljuk 5 mmol/l koncentrációjú és 0,2 mol/l-es K2C03 oldattal 8,5-es pH- értékre beállított NaCl-oldat 10 ml-ében. A harmadik mosást követően a kimosott konjugátot ebben a közegben tároljuk 2—8 °C-on. 10.3. HCG meghatározása TRIS-szel pufferolt és Aj20mnm—2,0 értékű konjugátot készítünk oly módon, hogy a tárolt konjugátot TRIS/ HCl-puffer 0,1 mol/1 koncentrációjú 10 g/l NaCl-ot, 1 g/l BSA-t és 4 g/l 6000-es molekulasúlyú polietilén-glikolt tartalmazó, 7,4-es pH-értékű oldatával hígítjuk. A TRIS-szel pufferolt konjugát 400 /rl-ét összekeverjük TRIS puffer 100 ^1-ével, vagy 2000 IU/1 HCG-t is tartalmazó TRIS puffer 100 ul-ével. 24 órás inkubálási idő után a HCG-t nem tartalmazó reakcióelegy A42c0mnmértéke 1,70 és 1,85 között változott. A HCG-t is tartalmazó reakcióelegy Aj2TMm-értcke pedig 0,40 és 0,70 között mozgott. XI. példa CuS-szolt alkalmazó HCG-agglutinációs teszt 11.1. CuS-szol részecskék készítése CuS-szolt oly módon állítunk elő, hogy 5 mmol CuS04-ot és 15 mmol/l etilén-dinitrilo-tetraecetsavas dinátriumsót tartalmazó oldaton H2S gázt buborékoltatunk keresztül 5 percen át 25 °C-on. A szol 100 ml-nyi részletét centrifugáljuk nitrogénatmoszférában 100 000 N/kg értéken. 11.2. Anti-HCG kapcsolása a CuS-szol részecskékhez A szupernatánst eldobjuk és minden szemcsét újradiszpergálunk 5 mmol/l NaCl-ot és 1 mg/ml tisztított anti-HCG-t (lásd 6.2. példát) tartalmazó oldat 20 ml-ében (pll-érték 6,0—6,5). A konjugátot centrifugálással 3-szor mossuk 100 000 N/kg értéken oly módon, hogy a szupernatánst eldobjuk, a szemcsét pedig újradiszpergáljuk 0,2 mol/l-es K2C03-oldat néhány cseppjével pH 8,5-es értékre állított 5 mmol/l NaCl-ot tartalmazó oldat 10 ml-eben. A 3. mosást követően a mosott konjugátot ebben a közegben tartjuk 2—8 °C-on nitrogén atmoszféra alatt, ledugaszolt üvegben. 11.3. HCG meghatározása TRIS-szel pufferolt és AJ2c0mnm=2,0 értékű konjugátot készítünk oly módon, hogy a tárolt konjugátot TRIS/ HCl puffer 0,1 mol/l koncentrációjú 10g/lNaCl-ot, 1 g/l BSA-t és 2,5 g/l 6000-es molekulasúlyú polietilén-gl ikolt tartalmazó, 7,4-es pH-jú oldatával hígítjuk. A TRIS- szel pufferolt konjugát 400 fx 1-ét összekeverjük TRIS- puffer 100 /ul-ével, vagy 4000 IU/1 HCG -t is tartalmazó TRIS-puffer 100 //1-évcl. 24 órás inkubálási idő után a HCG-t nem tartalmazó reakcióelegy Aj2c0mnm-értéke 1,60 és 1,80 között változott. A HCG-t is tartalmazó reakcióelegy Aj2c0mnm-értéke pedig 0,100 és 0,300 között mozgott. XII. példa Co3()4-szol részecskéket alkalmazó HCG-agglutinációs teszi 12.1. Co304-szol részecskék készítése Co304-szolt oly módon állítunk elő, hogy egy 10 mmol/l koncentrációjú Co(II)-acetát oldatot 4 órán át 100 ’C-on tartunk. Szobahőmérsékletre történő lehűtés után a szol 100 ml-nyi részét centrifugáljuk 80 000 N/kg értéken. 12.2 Az anti-HCG kapcsolása a Co304-szol részecskékhez A szupernatánst eldobjuk és minden egyes szemcsét újradiszpergálunk 5 mmol/l-es NaCl oldat 20 ml-ében 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
