181659. lajstromszámú szabadalom • Fémszol-részecskével jelzett immuno-vizsgálati módszer
17 181659 18 4. A mélyedéseket szívatással kiürítjük és háromszor átmossuk 300 fii 0,01 mol/1 TRIS/HCl/NaCl pufferrel (pH=7,4), amelyhez 0,5 g/l Tween 20-at adtunk. 5. 100 fi 1 0,1 mol/1 HC1 desztillált vizes oldatát pipettázzuk a mélyedésekbe és 30 percig rázás közben állni hagyjuk. 6. Az ezen oldatból vett mintát kis térfogatok mérésére alkalmas spektrofotométerbe helyezzük és megmérjük a fényabszorpciót 536 nm-en, vagy pedig a fényabszorpciót in situ mérjük a Microelisa-lemez mélyedésekben a Multiskan : Microelisa-leolvasó rendszer segítségével ugyancsak 536 nm-en. 5.6. Eredmények Aj3g“m értékét 0,230-nak találtuk 512 haemagglutinációs gátlási (HAI) titerű szérum esetében, valamint egy elfogadható lineáris korrelációt állapítottunk meg vizsgált humán szérum HAI titere és a fentiekben említett vizsgálat révén nyert A53c6mnm értékek között. VI. példa Humán koriongonadotropin (HCG) meghatározása vas-oxid anti-HCG konjugáttal 6.1. A vas-oxid szol készítése 9 mmol/1 FeCl3-at és 1 mmol/l HCl-t tartalmazó oldatot 95 'C-ra hevítünk 65 óráig. A kezdetben enyhén sárgás színű oldat narancssárga-vörösre színeződik, a vas-oxid szol részecskék képződése következtében. Az ily módon nyert kocka alakú vas-oxid részecskék éleinek 40 és 80 nm közötti méreteit elektronmikroszkóppal igazoltuk. A fényabszorpciós maximumot 370 nm-nél találtuk. Közvetlenül az előállítás után 0,45 mmol/l vas-oxid tartalmú szol A37c0mnm értéke 1,0 és pH-ja 2,7. 6.2. Vas-oxid anti-HCG konjugát készítése A nyúl anti-HCG szérumot olyan eljárás szerint készítettük, amely analóg az 1.2. példában anti-HPL szérumra leírtakkal. Ennek immunoglobulin frakcióit Na2S04 hozzáadásával nyertük, a maradékot elkülönítettük, az utóbbit 180 g/l Na2S04 koncentrációjú oldatban redíszpergáltuk és ezt a diszperziót 5 mmol/l NaCI-t tartalmazó oldat ellen dializáltuk. Az immunoglobulin tartalmat az 1.3. példában leírtak szerint határoztuk meg. A 6.1. szerinti vas-oxid szolt úgy hígítottuk, hogy a vas-oxid tartalma 0,45 mmol/l legyen. Ennek 25 ml-éhez 0,5 ml 250 g/l koncentrációjú glutáraldehidet adtunk, a keveréket 30 percig szobahőmérsékleten és 2,8-as pH értéken inkubáltuk. Ezután 640 fig/ml immunoglobulint tartalmazó 0,63 ml nyúl anti-HCG immunoglobulin oldatot adunk hozzá. Egy órás inkubálás után, szobahőmérsékleten az elegy pH-ját NaOH oldatával, 7,0-re állítottuk és az inkubálást 0 és 4 °C között egy éjen át folytattuk. Felhasználás előtt a konjugátumot centrifugálással átmostuk, a szupernatánst leszívattuk és 0,1 mol/1 TRIS/ NaCl/HCl-t (pH=7,4), 1 g/l BSA-t és 0,2 g/l Carbowax 20M-t tartalmazó pufferoldatban redíszpergáltuk. Végül a szol térfogatát úgy állítottuk be, hogy az A37c0mnm értéke 1,0 legyen. 6.3. Microelisa lemezek nyúl anti-HCG immunoglobulinnal történő bevonása A Microelisa lemezeket oly módon vonjuk be nyúl anti-HCG immunoglobulinnal, mint ahogy az 1.5. példában anti-HPL immunoglobulinnal történő bevonást leírtuk. 6.4. Vas-oxid anti-HCG konjugáttal történő HCG meghatározás vizsgálati előirata A HCG-t 0,04 mol/1 foszfát-puffért, 1 g/l BSA-t és 9 g/l NaCl-t (pH=7,4) tartalmazó oldatban oldottuk fel és a következő vizsgálati előirat szerint készítettük el a HCG dózis-válaszgörbét. 1. Anti-HCG-vel borított Microelisa lemez mélyedésébe a standard HCG oldat 0,1 ml-ét pipettázzuk és 37 °C-on 2,5 órán át inkubáljuk, 2. A mélyedéseket szívással kiürítjük. 3.0,1 n i vas-oxid anti-HCG-t (A37c0mmn=l,0) pipettázunk a lemez mélyedésébe és egy éjen át 37 °C-on inkubáljuk. 4. A mélyedéseket szívatással kiürítjük és 0,1 mol/1 TRIS/HCl/NaCl puffert (pH -7,4) és 0,5 g/l Tween 20-at tartalmazó oldat 0,3 ml-ével nyolcszor átmossuk. 5. Ezt követően 0,1 mol/l NaOH-t tartalmazó oldatot pipett izünk abba és 15 percig állni hagyjuk. 6. Ezen oldatból vett mintát helyezzük kis térfogatok mérésére alkalmas spektrofotométerbe és mérjük a fényabszorpciót 360 nm-en, vagy pedig a fényabszorpciót in situ mérjük a Microelisa lemez mélyedésekben a Multiskan: Microelisa leolvasó rendszer felhasználásával ugyancsak 360 nm-en. A dózisválaszgörbe adatait a következő táblázatban adjuk meg. A standard oldatban ievő HCG koncentráció milli-nemzetközi egység (m IU) ml egységben .lem A 360 nm 2000 0,367 1000 0,429 500 0,414 250 0,304 125 0,275 63 0,205 31 0,179 16 0,172 8 0,154 4 0,142 0 0,096 6.5. Terhes női vizeletben levő HCG meghatározása A terhes női vizeletet oly módon hígítjuk, hogy a HCG szintje 1 és 500 mIU HCG/ml között legyen. Az 5.4. pontban leírt vizsgálati előirat szerint a hígított minták HCG kcncentrációját a standard-görbe segítségével meghatároztuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
