181659. lajstromszámú szabadalom • Fémszol-részecskével jelzett immuno-vizsgálati módszer
15 181659 16 Humán anti-rubeola szérum titerének meghatározása 5.1. Rubeola antigén készítése 200 ml gazdasejt szuszpenziót (BHK 21C3, Rijks Instituut voor Volksgezondheid, R1V), melynek táptalajban levő koncentrációja 105 élősejt per ml, öntünk 490 cm2 felületű gömblombikba. A sejtkultúrát 16— 20 óráig 37 °C-on tartjuk. A táptalajt ezután eltávolítjuk és a sejtréteget kétszer 20 ml, foszfát-puffért tartalmazó sóoldattal (PBS) átmossuk. (A gazdasejtek szuszpendálásához, illetve a sejtréteg mosásához 9 g/1 nátrium-kloridot és a pH 7,4-re beállításához 0,04 mol/liter foszfátot tartalmazó pufferolt vizes oldatot használunk.) 10 ml vírus szuszpenziót (M33 RIV vírus) PBS-sel 1:100 arányban felhígítjuk, a lombikba visszük és az egészet 37 °C-on kb. 21/2 óráig inkubáljuk. 100 ml fenntartó táptalajt (a Gipcon cég MÉM márkanevű tápoldatát) adagolunk és a kultúrát 37 “C^on tartjuk. Legalább 64 órás periódus után, nem lépve túl a 136 órát — a citopatogén effektus megítélésétől függően — a fertőzött sejtek inkubált monorétegét összegyűjtjük. A fenntartó réteget eltávolítjuk és a sejteket a falról fellazítjuk egy steril üvegbottal, hozzáadunk 90 ml PBS-t és —20 °C-on fagyasztjuk. Olvasztás után szilárd NaOH-val 9,0 pH-ra állított 10 ml 1 mol/1 glicin oldatot adunk 90 ml sejt-szuszpenzióhoz és az egészet 6 órán át erélyesen keverjük 37 °C-on. A sejt-szüszpenziót ultrahanggal kezeljük 30 percig jéghűtés mellett, ezt követően 30 000 N/kg értéken 30 percig és 4 °C-on centrifugáljuk. A rubeolavírust tartalmazó szupernatánst összegyűjtjük és az alábbiak egymásutáni hozzáadásával inaktiváljuk : 1:100 (v/v) arányban NaOH desztillált vizes oldata (1 mol/l), 1:100 (v/v) arányban frissen készített 10%-os /3-propiolakton desztillált vizes oldata. A folyadékot 48 órán át 4 °C-on állni hagyjuk, majd centrifugáljuk 30 000 N/kg értéken és 4 °C-on. A szupernatáns a rubeola-vírust tartalmazó közeg, amely szükség esetén —20 °C-on tárolható a felhasználásig. 5.2. Microelisa lemezek rubeola antigénnel történő bevonása Az 5.1. pontban leírtak szerint készített rubeola antigén oldatot 1:100 arányban 0,05 mol/1 karbonát-pufferrel hígítjuk, amelynek pH-ja 9,6. 100 fű rubeola antigén oldatot pipettázunk a Microelisa lemez valamennyi mélyedésébe és az egészet 16 órán át inkubáljuk 4 °C-on. A Microelisa lemez mélyedéseit szívatással kiürítjük és 7,4 pH-jú 300 fii 0,05 mol/1 foszfát-pufferrel háromszor mossuk, amelyhez 9 g/l NaCl-t és 0,5 g/1 Tween 20-at adtunk. 5.3. Juh anti-humán immunoglobulin oldat készítése Normál humán vérsavót 140 g/l Na2S04-gyel kisózunk, amelyet szilárd állapotban kis részletekben adagolunk. Szobahőmérsékleten történő 1 órás állás után a V. példa zavaros elegyet 25 000 N/kg értéken 10 percig centrifugáljuk. A szupernatánst szívatással eltávolítjuk, majd a maradékot 140 g/1 Na2S04 desztillált vizes oldattal mossuk. A centrifugálás és a szupernatáns szívatással eltávolítása után a maradékot 9 g/1 NaCl-ben feloldjuk, ezt követően az immunoglobulin oldatot 48 órán át 9 g/1 koncentrációjú NaCl-oldat ellen dializáljuk 4 °C-on. Az immunoglobulin tartalmat AjGc0mnm—Ajgc0mnm módszer segítségével határozzuk meg. A juhokat ilyen immunoglobulin hígított oldatával immunizáltuk a következő eljárás alapján : 1. nap 0,5 mg humán immunoglobulin, amelyet 0,5 ml fiziológiás sóoldatban oldottunk és amelyhez 0,5 ml komplett Freunds adjuvánst adtunk. Injekciózás módja : intramuszkuláris. 14. nap 1,0 mg humán immunoglobulin, amelyet 0,5 ml fiziológiás sóoldatban oldottunk és amelyhez 0,5 ml komplett Freunds adjuvánst adtunk. Injekciózás módja : intramuszkuláris. 28. nap 2,0 mg humán immunoglobulin, amelyet 0,5 ml fiziológiás sóoldatban oldottunk és amelyhez inkomplett Freunds adjuvánst adtunk. Injekciózás módja : intramuszkuláris. 42. nap 1,0 mg humán immunoglobulint oldottunk 1,0 rr l fiziológiás sóoldatban. Injekciózás módja : intravénás. 56. nap vérvétel. Az immunoglobulin frakciókat juh anti-humán immunoglobulin szérumból nyertük a fentiekben leírt módszer alapján, 140 g/1 Na2S04-gyel történő kisózással. A harmadik mosás után a maradékot 9 g/1 NaCl-ben oldtuk fel, majd az immunoglobulin oldatot 0,3 g/l koncentrációjú NaCl desztillált vizes oldatával szemben dializáltuk, amelynek a pH-ját 0,2 mol/l, desztillált vízben oldott K2C03-mal 7-re állítottuk. Ezt a dializált juh anti-humán immunoglobulin oldatot 160000 N/kg értéken 15 percig centrifugáltuk, majd az immunoglobulin tartalmat az Aj6c0mnm—Aj8c0mnm módszer segítségével meghatároztuk. "5.4. Arany részecske—juh anti-humán immunoglobulin konjugát készítése Az arany-szolt az 1.1. pontban leírtak szerint készítettük és a konjugátoí az 1.4. pontban leírt módszerrel analóg módon állítottuk elő, amikoris az 5.3. pontban leírt juh immunoglobulin oldatot használtuk, melynek immunoglobulin tartalma 125 /tg/ml volt. 5.5. Vizsgálati előirat A humán vérsavó mintát 1 :25 arányban hígítjuk, 7,4-es pH-jú 0,2 mol/l TRIS/HCl/NaCl pufferrel, melyhez 0,5 g/1 Tween 20-at adunk. 1. 100 fi) hígított humán szérumot pipettázunk mindegyik mélyedésbe és ezeket 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. 2. A mélyedéseket szívatással kiürítjük és háromszor átmossuk 300 fii 0,2 mol/l TRIS/HCl/NaCI pufferrel (pH=7,4), amelyhez 0,5 g/l Tween 20-at adtunk. 3. 100 fii arany részecske—juh anti-humán immunoglobulin konjugátot (As3c6mnm=l,00) pipettázunk a mélyedésekbe és az egészet 16 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
