181659. lajstromszámú szabadalom • Fémszol-részecskével jelzett immuno-vizsgálati módszer
13 181659 14 rát-dihidrát koncentrációjú desztillált vizes oldatot adjuk hozzá. Ehhez az oldathoz 4,00 ml 10 g/l hidrazin koncentrációjú desztillált vizes oldatot adjuk erős keverés mellett, mágneses keverőt használva. A szürkéssárgás-zöld ezüst-szol — erős Tyndall szórással — 60 másodpercen belül kialakul. Desztillált vízzel történő tízszeres hígítás után a pH értéke 8,85 volt, és a szol fényabszorpciója Aj1c6mnm=0,83. A nem hígított szol 20 ml-ét 10 percig 25 000 N/kg értéken centrifugáltuk. 15 ml szupernatánst szívatással eltávolítottunk és hozzáadtunk 15 ml 0,1 g/l trinátriumcitrát-dihidrát desztillált vizes oldatát (pIT 6,88). A mosási műveletet még kétszer megismételtük. Az utolsó mosás után a térfogatot 0,1 g/l nátrium-citrát oldattal 20 ml-re kiegészítettük. Desztillált vízzel történő négyszeres hígítás után a szol jellemzői a következők voltak : >-Amax = 416 nm AJr„m 1,12 pH=7,0 4.2. A tesztoszteron-lla-hemiszukcinát-BSA készítése 40 mg tesztoszteron-lla-hemiszukcinátot 2 ml dimetil-formamidban (DMF) oldunk és az oldatot —15 °C-ra hűtjük. 140 mg marha vérsavó albumint 3 ml desztillált vízben feloldunk, miután 1 csepp 4 n NaOH-t és 2 ml DMF-t adunk hozzá és az egészet —15 °C-ra lehűtjük. 12,5 ,ul N-metilmorfolint és 12,5 fj, 1 klórhangyasav izobutilésztert adunk a szteroid oldathoz. 3 perc után az oldatot a BSA oldathoz öntjük. —15 °C-on történő 1 órás és 0 °C-on történő 3 órás keverés után az oldatot átvisszük egy dializáló zsákba és egy éjen át dializáljuk állandó folyó csapvíz ellen. A dializátumot Sephadex G 25 oszlopon engedjük át, kívánt esetben centrifugálás után, és a protein frakciókat összegyűjtjük és liofilezzük. 4.3. Antiszérum készítése a tesztoszteronhoz A nyulakat 1,25 mg tesztoszteron-lla-hemiszukcinil-BSA injekcióval — amelyet 2,5 ml fiziológiás konyhasóoldatban oldottunk fel — és 2,5 ml komplett Freunds adjuvánssal (1 ml i. m. 3 x 1 hetes időközönként) immunizáltunk. Majd 5 ml fiziológiás konyhasóoldatban levő, 1,25 mg tesztoszteron-lla-hemiszukcinil-BSA oldatból 1 ml-t intravénásán injekcióztunk. Ezt az injekciósorozatot addig ismételtük, míg az antiszérum titere kielégítő mértékű volt ahhoz, hogy a vizsgálatot elvégezhessük. A nyulakat ezután kivéreztettük és a vérsavót —20 °C-on tároltuk a felhasználásig. 4.4. Tesztoszteron elleni nyúl immunoglobulinnal bevont polisztirol csövek készítése A nyúl aníi-tesztoszteron immunoglobulin oldatot 180 g/l Na2S04-tal történő kisózással készítjük, miként az 1. példa 2. pontjában már leírtuk. A dializált immunoglobulin oldatot egy olyan puffernd hígítjuk, amely 0,1 mol/1 NaH2P04xH20-t, 60 g/l szacharózt tartalmaz és amelynek a pH-ját 4 mol/1 NaOH-val 7,4-re állítottunk. A hígítást 1 jig immunoglobulin/ml koncentrációig végezzük. 1 ml immunoglobulin oldatot pipettázunk a 3 ml-es polisztirol cső mindegyikébe és egy éjen át inkubáljuk szobahőmérsékleten. A csöveket ezután szívatással kiürítjük és 1 ml, a fenti puíferben oldott 10 g/l BSA oldattal töltjük meg. Két óra után a csöveket leszívatjuk és 3 ml desztillált vízzé’ háromszor átmossuk. A csöveket szívatással teljesen megszárítjuk, majd egy éjen át szilikagél fölött tovább szárítjuk. Végül alumínium fóliába csomagoljuk a 25 db-os készletet tartalmazó szilika-gél zacskót és 4 °C-on tároljuk. 4.5. Ezüst részecske-tesztoszteron-lla-hemiszukcinil-BSA konjugátum készítése A 4.1. pontban leírtak szerint készült ezüst-szol 20 ml-ét 80 ml 0,3 g/l NaCl-dal hígítottuk és a pH-t 7-re állítottuk 0,01 mol/l NaOH desztillált vizes oldatával. Aj2jnlm : 1,08. 3 ml tesztoszteron-lla-hemiszukcinil-BSA oldatot — amelynek koncentrációja 175 ug/ml, 0. 01.mol/í NaOH-val 7,0-es pH-ra állított 0,3 g/l NaClben — adunk cseppenként az előbbi szolhoz élénk keverés mellett, amelyet mágneses keverővei végzünk. A/ egészet kb. 10 percig inkubáljuk, majd hozzáadunk 2 ml 10 g/l Carbowax 20M (az Union Carbide amerikai egyesült államokbeli cég által gyártott műgyanta) oldatot, melynek pH-ját 0,01 mol/1 NaOH-val 7-re állítottuk. A nyers konjugátumot ezután centrifugáljuk 25 000 N/kg értéken 20 percig. 9 ml szupernatánst most is szívatással távolítunk el és 9 ml mosófolyadékkal helyettesítjük, amely 0,3 g/l NaCl-ben 1 g/l Carbowax 20M oldatát tartalmazza és pH-ja 7,0-ra van állítva 0,01 mol/1 NaOH desziilláit vizes oldatával. Háromszori mosás után a konjugátumot ismét centrifugáljuk, aztán a szupernatáns folyadékot leszívatjuk. A maradékot 0,02 mol/1 foszfát-pufferben rediszpergáljuk, melynek pH-ja 7,4. A ke njugát oldatnak akkor a pH-ja 7,4 és Aj2jn}un= 1,08. A nyert konjugátumot 4 °C-on tároljuk egészen a felhasziálásig. 4.6. Vizsgálat leírása ezüst részecske-tesztoszteron-1 la-hemiszukcinil-BS A konjugátummal végzett tesztoszteron meghatározásához 1. 1 ml mintát polisztirol csőbe pipettázunk, mely nyúl anti-tesztoszteron immunoglobulinnal van bevonva és 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. 2. A csöveket kiürítjük és 2 ml 7-es pH-jú 0,02 mol/1 fcszfát-pufferrel háromszor átmossuk. 3. 1 ml ezüst részecske-tesztoszteron-Hoc-hemiszukcinil-BSA konjugátumot (Ai2‘f'nm=l,08) pipettázunk a csőbe és 16 órán át inkubáljuk. 4. A csövet üresre szívatjuk és 2 ml 7-es pH-jú 0,02 mol/1 fcszfát-pufferrel átmossuk. 5. 1 ml 0,1 mol/1 HC1 desztillált vizes oldatot a csőbe pipettázunk és 30 percig állni hagyjuk. 6. A csőben levő folyadék Aj2TMm értékét megmérjük. 4.7. Eredmények A vizsgálati közeget a standard görbe alapján kolorimetfikusan határoztuk meg, amikoris 0,5 ng/ml és ennél nagyobb tesztoszteron mennyiségek meghatározhatóak. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
