181659. lajstromszámú szabadalom • Fémszol-részecskével jelzett immuno-vizsgálati módszer
27 181659 28 16.4. Arany-részecske—antitest konjugát Az arany-szol pH-ját 7,0 értékre állítjuk be 0,2 mol/1 koncentrációjú K2C03-oldat hozzáadásával. 250 yg fehérje/ml koncentrációjú, hígított antitest-oldat 2 ml-ét hozzáadjuk 100 ml semlegesített arany-szolhoz (A54c0mnm= = 1,0). Az elegyet 10 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten, majd Carbowax 20M-et 10 g/1 koncentrációban és NaCl-ot 5 mmol/1 koncentrációban tartalmazó, 7,0 pH-jú oldat 2 ml-ét adjuk hozzá. 1 órás szobahőmérsékleten történő inkubálás után az arany-részecske— antitest konjugátumot centrifugáljuk 20 percen át 50 000 N/kg értéken. A sötétvörös szemcsét újradiszpergáljuk olyan közegben, amely NaCl-ot 5 mmol/1 koncentrációban, Carbowax 20M-et 0,2 g/1 koncentrációban és thiomersal-t 0,1 g/1 koncentrációban (pH = =7,0) tartalmazott. A végtérfogatot úgy állítjuk be, hogy az elegy Aj4c0mnm-értéke közelítőleg 1,1 legyen. 16.5. Ezüst-részecske—antitest konjugát 1300 ygjm\ koncentrációjú, hígított antitest oldatot adunk hozzá 100 ml ezüst-szolhoz (pH=7,5; Aj2c0mnm= = 1,0). 10 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten. Ezt követően 10 g/1 Carbowax 20-at és 5 mmol/l NaCl-ot (pH=7) tartalmazó oldat 2 ml-ét adjuk hozzá. Szobahőmérsékleten történő 1 órás inkubálás után a konjugátot centrifugáljuk 125 000 N/kg értéken 20 percen keresztül. A sötétbarna szemcsét újra diszpergáljuk 5 mmol/l NaCl-ot, 0,2 g/l Carbowax 20M-et és 0,1 g/1 Merthiolate-t (pH=7,0) tartalmazó oldatban. A végső térfogatot úgy állítjuk be, hogy az A'2^nm-értéke közelítőleg 1,1 legyen. A konjugátot sötétben 0—4 °C-on tároljuk. 16.6. A mikrotitrációs lemezek bevonása A holland Greiner cég által az ugyancsak holland Organon cég számára előállított polisztirol anyagú mikrotitrációs lemezek mélyedéseit egyenként 0,1 ml anti- HPL tartalmú oldattal, vagy anti-HPL és anti-HCG 1 : 1 arányú keverékét tartalmazó oldattal vonjuk be Wolters és munkatársai módszere szerint [J. Clin. Path., 29, 873—879 (1976)]. 16.7. HRP-vel jelzett anti-HPL konjugátok Torma-peroxidázt (rövidítve HRP; gyártja a Miles Laboratories amerikai cég RZ 3.0 szám alatt) kapcsolunk nyúl anti-HPL-hez Wolters és munkatársai módszere szerint (lásd az előző pontban). 16.8. HRP-szubsztrátum oldat készítése A HRP-szubsztrátum oldat 0,1 mol/1 nátrium-foszfát-citromsav puffer (pH=5,0), 0,002 mol/1 orto-fenilén-diamin-dihidrokloridot és 0,1 mol/1 H202-t tartalmaz. 16.9. Szimultán szendvics SPIA HPL-re és HCG-re A fenti 0,02 mol/l-es foszfát pufferben feloldott, ismert mennyiségű HPL-t és HCG-t tartalmazó minta (vagy vakminta) 0,1 ml-ét belepipettázzuk az anti-HPL-lel és anti-HCG-vel bevont mikrotitrációs lemez mélyedésébe, majd 2 órán keresztül 37 "C-on inkubáljuk. Ezt követően hozzáadjuk az arany-részecske—anti-HCG konjugátot (Aj4c0mnm=l,0) és az ezüst-részecske—anti-HPL konjugátot (Aj2TMm=l,0) egyenlő mennyiségben tartalmazó TRIS-pufferes oldat 0,1 ml-ét és a reakcióelegyet 37 °C-on inkubáljuk egy éjszakán át. A mélyedéseket ezután kiszívatjuk és 6-szor átmossuk 0,3 ml, 0,1 mol/1 TRIS-puffert és 0,5 g/1 Tween 20-at tartalmazó oldattal, hogy elrávolítsuk a nem megkötődött konjugátot. Végül 0,11 ml 0,1 mol/l-es HCl-oldatot adunk hozzá a megkötött immúnkomplex disszociálása céljából. 5 perc után a mélyedés tartalmát homogenizáljuk. 2 ul-es aliquot részből az atomabszorpciót az arany és az ezüst jelenléte miatt egymásután mérjük szénrudas atomabszorpciós spektrometriás úton. Az arany atomabszorpcióját 242,8 nm-en mérjük és a HCG koncentrációjához viszonyítjuk. Az ezüst atomabszorpcióját 338,4 nm-en mérjük és a HPL koncentrációjához viszonyítjuk. 16.10. Műszerek Az arany és ezüst atomabszorpciójának mérését egy Varian AAG-típusú atomabszorpciós spektrofotométerrel végeztük, ami CRA 63 típusú szénpálcával és BC 6-típusú háttér korrektorral van felszerelve. Minden méréshez 2 yl-es aliquot részt pipettázunk a szénpálcába. Ha az abszorpció az 1,0 értéket túlhaladja, akkor a mintát hígíijuk és a mért abszorpciót megszorozzuk a megfelelő hígítási faktorral. 16.11. Eredmények Hígítási sort készítünk egy olyan oldatból, ami mind HPL-t, mind pedig HCG-t tartalmaz, majd a sorozatra elvégezzük a mérést. A kapott eredményeket az alábbi tábláza ban mutatjuk be : [HPL] [pmól/1] A338 4 nm [HCG] [IU/1] A242 8 nm 0,68 1,24 0,125 0,60 1,36 1,59 0,250 0,75 2,72 1,59 0,50 0,93 5,44 1,98 1,0 1,25 10,9 2,19 2,0 1,65 21,8 2,39 4,0 2,6 43,5 3,03 8,0 4,6 87 3,28 16,0 6,9 174 3,59 32,0 10,5 348 3,96 64,0 13,0 696 3,83 128,0 13,8 Ugyanezen teszt-előirat alapján határozzuk meg a hígított szérum minták HPL- és HCG-tartalmát is a kalibrációs görbe felhasználásával. XVII. példa Reagenscsomag vizelet HCG-tartalmának egyszeri meghatározására agglutinációs reakcióval A reagenscsomag az alábbi összetételű : (i) A 7.1. pontban ismertetett módon előállított (fagyasztva szárított) anti-HCG—arany-szolt tartalmazó fiola, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
