181659. lajstromszámú szabadalom • Fémszol-részecskével jelzett immuno-vizsgálati módszer
25 181659 26 15.2. Arany-szol részecskék előzetes bevonása Az arany-szol részecskék előzetes bevonását Carbowax 20M-mel végezzük a következő módon: a 7,1-es pH-értékre állított arany-szol 100 ml-ét összekeverjük 7.1- es pH-ra beállított és Carbowax 20M-et 1 g/1 koncentrációban tartalmazó oldat 0,5 ml-ével. 15 perces rázás után az arany-szol részecskéket centrifugáljuk 10 percen át 25 000 N/kg értéken, majd újra szuszpendáljuk az 1. pontban ismertetett pufferban és centrifugálással kétszer átmossuk. 15.3. Az előbevont arany-szol részecskék bevonása Az utolsó mosási lépés után az előbevont arany-szol részecskéket újra szuszpendáljuk egy, a fenti puffert és polimerizációs elegyet tartalmazó oldatban. A polimerizációs elegy 1,1 g metil-metakrilátból, 0,35 g metakrilsavból, 1,0 g bidroxietil-metakrilátból és 0,1 g etilén-glikolból áll. A polimerizációs reakció megindítása céljából az oldathoz 1 mg ammónium-perszulfátot adunk. A szuszpenziót enyhén rázzuk 1 órán keresztül 95 °C-on, amikorra 15—25 nm vastagságú polimerréteg alakul ki az arany-részecskéken. Az ily módon bevont arany-részecskéket 10 percen át centrifugáljuk 20 000 N/kg értéken, majd újra szuszpendáljuk az 1.4. pontban ismertetett módon és kétszer mossuk centrifugálással. 15.4. Összekapcsolás az anti-HPL-immúnglobulinnal Az anti-HPL-immúnglobulinos összekapcsolást megelőzően az arany részecskék polimer bevonatát kémiailag átalakítjuk. Ebből a célból a részecskéket újra szuszpendáljuk 0,01 mol/1 koncentrációjú vizes diamino-heptán oldat (pH 7) 50 ml-ében, amihez még 0,1 mg l-etiI-3- -(3-dimetilamino-propil)-karbodiimidet adunk. Ezt a szuszpenziót gyengén rázzuk 2 órán át 8 °C-on és ezt követően háromszor dializáljuk 0,1 mol/l-es, 7,0-es pH- jú foszfát puffer oldattal szemben. Az ily módon kapott szuszpenziót az utóbbi foszfát-pufferben felhígítjuk 95 ml-es végtérfogatra, majd az elegyhez 5 ml 25%-os glutáraldehidet adunk. Ezt a keveréket 1 órán keresztül 25 °C-on rázzuk. A fölös mennyiségű glutáraldehidet PBS-sel szembeni 3-szori dializálással távolítjuk el. A keletkező szuszpenzióhoz hozzáadjuk az 1.3. pont szerint előállított anti-HPL-immunoglobulin oldat 2 ml-ét (125 fig immunoglobulin per ml) és 25 °C-on enyhe rázás közben reagáltatjuk. 5 óra elteltével a reakciót megállítjuk 100 ml 0,1 mol/l koncentrációjú és 7.1- es pH-jú glicin oldat hozzáadásával, majd a szuszpenziót további két órán át 25 °C-on rázzuk. Az anti-HPL-immunoglobulinnal ily módon bevont részecskéket háromszor mossuk PBS-sel, közben 2000 N/kg értékű centrifugálást alkalmazván. 15.5. HPL meghatározása TRIS-szel pufferolt és Aj3c6TMm=2,0 értékű konjugátot készítünk oly módon, hogy a konjugátot TRIS/HC1 puffer 0,1 mol/l koncentrációjú és 10 g/1 NaCl-ot tartalmazó 7,4-es pH-jú oldatában diszpergáljuk. Ezen TRIS- szel pufferolt konjugát 400 jul-ét összekeverjük a TRIS- puffer 100 jul-ével, vagy 300 ng/ml HPL-t is tartalmazó TRIS-puffer 100 /il-ével. 22 órás inkubálási idő után a HPL-t nem tartalmazó reakcióelegy A;3c6mnm-értéke 1,8 volt. A HPL-t tartalmazó reakcióelegy Aj3c6”m-értéke kb. 0,35 veit. XVI példa HPL és HCG szimultán meghatározása arany-szol és ezüst-szol részecskék alkalmazásával 16.1. Arany-szol A 60 nm átlagos nagyságú (elektronmikroszkóppal mérve) arany-szol részecskéket az 1.1. példában ismertetett módszer szerint állítjuk elő. Az előállítás után az arany-szolt A)4c0mnni — 1,1 -es abszorpciós értékre hígítjuk. 16.2 Ezüst-szol 58,9 mmol/1 koncentrációjú AgN03-oldat 8,5 ml-ét összekeverjük 34 mmol/1 koncentrációjú nátrium-citrát-dihidrát oldat 5 ml-ével és 500 ml-re hígítjuk. Erőteljes keverés mellett hozzáadjuk 10 ml/l-es hidrazin-hidrátoldat (80%-os Backer-féle minőség) 40 ml-ét és az elegyet 15 percig keverjük. A polidiszperz szolt ismételt centrif jgálással frakcionáljuk kétszer 80 000 N/kg értéken 20 percig és egyszer 3000 N/kg értéken 5 percig történő centrifugálással ; az ily módon létrejött frakció 40— 60 nm közötti méretű részecskéket tartalmaz az elektronmikroszkópos mérések tanúsága szerint. Ezt a frakciót 0,34 irmol/1 koncentrációjú nátrium-citrát-dihidrát-oldatban tároljuk 7,5-es pH-értéken és hígítjuk Aj2gnjim= = 1,0 értékre. 16.3. Antiszérumok Anti-HPL-szérumot az 1.2. pontban ismertetett módon állítunk elő. Anti-HCG-szérumot nyulak immunizálásával állítunk elő az 1.2. pontban ismertetett eljárással analóg módon, de HCG preparátumok alkalmazásával. Az antiszérumokat fagyasztva szárítjuk és —25 °C-on tároljuk a felhasználás időpontjáig. Az antitest oldatokat fagyasztva szárított antiszérumból állítjuk elő oly módon, hogy az antiszérumot feloldjuk 0,15 mol/l koncentrációjú, 7,0 pH értékű NaCl-ban, majd pedig Na2S04-al [végkoncentrációja 1,27 mol/l] kicsapjuk az antitest-frakciót a Kekwick által leírt módon [Biochem J., 34, 1248—1257 (1940)]. A csapadékot feloldjuk 0,15 mol/l koncentrációjú és 7.0 pH-értékű NaCl-oldatban és alaposan dializáljuk 7.0 pH-jú 5 mmol/1 koncentrációjú NaCI-oldattal szemben, vagy pedig 7,0 pH-jú és 0,15 mol/l koncentrációjú NaCl oldattal szemben. Az 5 mmol/1 koncentrációjú NaCl oldattal (pH=7) szemben dializált antitest-oldatokat konjugát készítmények előállítására használjuk, A 0,15 mol/l koncentrációjú NaCl oldattal (pH=7) szemben dializált oldatokat pedig mikrotitrációs lemezek bevonására alkalmazzuk. A lecsapódott euglobulinokat 10 perces és 200 000 N/kg értékű centrifugálással távolítjuk el. A törzsoldatot 13 mg/ml protein koncentrációra állítjuk be és 1 ml-es aliquot részekben —20 °C-on tároljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
