181534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A/16686 jelű antibiotikum előállítására
181)34 tot ezt követően 35 C° alatti hőmérsékleten vákuumban betöményítjük, így 6 liter butanolos koncentrátumot kapunk. Ezt a koncentrátumot petroléterhez adjuk és a kapott csapadékot dekantálással elválasztjuk, majd további petroléterhez adjuk. A szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük és 5 vákuumban szobahőmérsékleten szárítjuk, így 26,3 g nyers A/16686 antibiotikumot kapunk, amelynek az M. I. C. értéke S. pneumoniae UC 41 ellen 0,8 pg/ml. 9 3. példa Az A/16686 antibiotikum tisztítása 47,7 g 2a. példa szerint előállított nyers A/l 6686 antibioti- 15 kumot 1,4 liter (4:7:2 arányú) kloroform : etanol : vízeleggyel (tf : tf : tf) kezelünk és a képződött olajos terméket dekantálással elkülönítjük az oldattól. További 70 ml fenti elegyet adunk az olajos termékhez és az elkülönítést megismételjük. Az olajos terméket 440 ml vizzel mossuk, majd a 20 megszilárdult anyagot szűréssel és centrifugálással elkülönítjük. a) Az elkülönített szilárd anyagot 170 ml vizben oldjuk, 400 ml metanolt adunk az oldathoz és szüljük. Ezután az oldószereket n-butanol hozzáadása mellett 35 C° alatti hő- 25 mérsékleten vákuumban kiűzzük az oldatból és így 50 ml butanolos koncentrátumot kapunk. A koncentrátumhoz 500 ml dietilétert adunk, ekkor csapadék képződik, amelyet szűréssel elkülönítünk és szobahőmérsékleten vákuumban szárítunk. Ily módon 1,012 g csaknem tiszta A/16686 anti- 30 biotikumot kapunk, amelynek az M. I. C. értéke S. pyogenes ellen 0,025 pg/'ml. A csaknem tiszta A/16686 antibiotikumot a következő módon tovább tisztítjuk: 1,58 g fenti A/16686 antibiotikumot, amelynek az M. I. C. értéke 0,025 pg/'ml, feloldunk 1:1 (tf/tf) arányú acetonitril/ 35 víz-elegyben és a keletkező oldatot olyan oszlopra visszük, amely 430 g szilikagél 60-t (Merck 0,06—0,2 mm) tartalmaz és ugyanilyen eleggyel készült. Az oszlopot először ugyanazzal az acetonitril/viz-eleggyel előhívjuk és 70 darab 20 ml-es frakciót szedünk le. Ezután acetonitril/0,01 n HCl-elegyet 40 (1:1 tf/tf arány) használunk és 290 darab ugyancsak 20 mles frakciót szedünk le. Az oszlop eluálását vékonyrétegkromatográfiával követjük 60 F254 szilikagél lapokon és meghatározzuk a frakcióknak Sarcina lutea elleni hatását. A 130—265 frakciókat egyesítjük és az oldószereket n-buta- 45 nollal kihajtjuk, így 20 ml n-butanolos koncentrátumot kapunk. A kapott kis térfogatú anyagot nagy mennyiségű etiléterbe öntjük és a képződött csapadékot szűréssel szántjuk. Ily módon 1,015 g A/16686 antibiotikumot kapunk. 0,67 g így kapott anyagot feloldunk 24 ml víz és 76 ml 40 metanol elegyében. A keletkező oldatot 3,0 x 62,0 cm méretű oszlopra visszük, amely 220 g Sephadex LH—20-at tartalmaz és 7:3 arányú (tf/tf) metanol/víz-elegyben készült. Az oszlopot ugyanazzal az eleggyel eluáljuk és 10 ml-es frakciókat szedünk le. A 24—32 frakciókat egyesítjük és az 55 oldószert vákuumban 35 C° alatti hőmérsékleten n-butanollal kiűzzük, így 10 ml butanolos oldatot kapunk. Ezt az oldatot etiléterhez adjuk és a kívánt tiszta A/16686 antibiotikumot kicsapjuk. A csapadékot szűréssel elkülönítjük, etiléterrel mossuk és vákuumban P205 felett szobahőmérsékle- 60 ten szárítjuk, így 0,26 g tiszta A/16686 antibiotikumot kapunk. b) A szűrletet vákuumban 35 C° alatti hőmérsékleten n-butanol hozzáadása mellett sztrippeljük és így 50 ml nbutanolos koncentrátumot kapunk. Petroléter hozzáadása 65 esetén csapadék képződik, amelyet szűréssel elkülönítünk és vákuumban szobahőmérsékleten szárítunk. Ily módon 42,9 g részben tisztított A/16686 antibiotikumot kapunk, amelynek az M. I. C. értéke S. pyogenes ellen 0,2 pg/ml. Ezt az antibiotikus hatású anyagot 2,5 liter vízben szuszpendáljuk és 1 n NaOH hozzáadása útján a pH 7-re állítása mellett oldjuk. A kapott vizes oldatot 5—5 liter n-butanollal háromszor extraháljuk és a szerves fázist vízzel való mosás után 200 ml-re betöményítjük vákuumban 35 C° alatti hőmérsékleten. Dietilétemek a koncentrátumhoz való hozzáadása után csapadék képződik, amelyet szűréssel elkülönítünk és vákuumban szobahőmérsékleten szárítunk. A száraz terméket 160 ml 2: 3 :4 (tf/tf/tf) arányú n-propanol : n-butanol : 1 n ammóniumhidroxid-elegy felső rétegében oldjuk. A keletkező oldatot 100 cm magas és 7,5 cm átmérőjű oszlopra viszszük, amely 1,7 kg szilikagél 60-t (Merck 0,06—0,2 mm) tartalmaz és a fenti oldószer-eleggyel készült. Az oszlopot ugyanazzal az eleggyel eluáljuk és 300 ml-es frakciókat szedünk le. Az oszlop eluálását vékonyrétegkromatográfiával követjük. A 21—26 frakciókat egyesítjük és az egyesített frakciókat n-butanollal sztrippeljük 35 C* alatti hőmérsékleten vákuumban, így 50 ml n-butanolos koncentrátumot kapunk. Dietiléter hozzáadásakor csapadék képződik, amelyet szűréssel elkülönítünk, dietiléterrel mosunk és vákuumban P2Os felett szárítunk szobahőmérsékleten. Ily módon 1,875 g majdnem tiszta A/16686 antibiotikumot kapunk, amelyet azután tovább tisztítunk az a) pontban leírt módon. Az A/16686 antibiotikum hidroklorid alakjában fehér, kristályos, gyengén higroszkópos anyag, amely 224— 226 C°-on olvad. Nagyon jól oldódik vízben és dimetilformamidban, oldható metanolban, etanolban, propanolban és butanolban, de nem oldódik etiléterben, petroléterben és benzolban. Az A/16686 antibiotikum-hidroklorid 140 C°-on közömbös légkörben való szárítás után a következő százalékos összetételt mutatja közelítőleg (néhány elemzés átlaga): szén: 51,73%; hidrogén 6,34%; nitrogén 9,96%; klór(összklórtartalom) 5,84%; klorid-ionok 4,74% és a maradék 1%. Az infravörös abszorpciós spektrum nujolban az 1. ábra diagramján látható. A következő abszorpciós maximumok voltak észlelhetők (cm '‘-ben): 3290—3070, 2930 és 2860 (nujol), 1765, 1630, 1510,1455,1375 (nujol), 1230,1175,1130,1065,1030,1015, 980,840 és 820. Az ultraibolya abszorpciós spektrumot a 2. ábra mutatja és a következő abszorpciós maximumokkal rendelkezik: a) metanolban 232 nm (Ej^ = 178) 265 nm (E^ = 107) b) 0,1 n HCl-t tartalmazó metanolban 231 nm (Ej^ = 167) 270 (Efi, = 96) c) 0,1 n NaOH-t tartalmazó metanolban 250 nm (Ej^ « 232) 295 nm (váll) d) 7,38 pH-jú puffert tartalmazó metanolban 231 nm (Ej*, = 167) 270 nm (E]%, = 96) Az ultraibolya abszorpciós spektrumokat Beckman DK—2 spektrofotométerrel határoztuk meg). Az A/16686 antibiotikum-hidroklorid fajlagos forgatóképessége: [a]g> = +49,T (c=0,43% DMF-ben). 10 5
