181534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A/16686 jelű antibiotikum előállítására
11 181534 12 Az A/l6686 antibiotikum a következő jellemző reakciókai mutatja: ninhidrin (3%-os etanolos oldat) negatív ninhidrin (3%-os etanolos oldat pozitív +nátriumacetát) pozitív 1% FeClj-1% K3Fe(CN)6 pozitív (zöld) (vizes oldat) Molisch pozitív Fehling negatív Biuret pozitív Anthron pozitív Millon negatív H2S04 konc. negatív KMn04 vizes pozitív Az A/16686 antibiotikum Rf értékeit papírkromatográfiár. úton meghatároztuk, amelynek során különböző eluáló sze reket és S. aureus ATCC 6538 organizmust használtuk. Az eredményeket a VII. táblázatban foglaljuk össze. VII. táblázat Az A/16686 antibiotikum kromatográfiás viselkedése (Whatman Nr. 1 papír)* Eluáló rendszerek Rf értékek 1. n-butanol pH 6-os Sörensen oldattal telítve 0,00 2. n-butanol 2% p-toluolszulfonsavat tartalmazó vízzel telítve 0,00 3. n-butanol 2% ammóniumhidroxidot tartalmazó vízzel telítve 0,00 4. Sörensen puffer, pH 6,0, n-butanollal telítve 0,05 5. n-butanol : metanol : víz 4:1:2 arányú elegye 0,43 6. etilacetát vízzel telítve 0,00 7. n-butanol : ecetsav : víz 2:1 • 1 arányú elegye 0,52 8. n-butanol : piridin : víz 4:3:7 arányú elegye 0,87 (A táblázat folytatása) Eluáló rendszerek Rf értékek * leszálló kromatográfia Rm: 40 cm Mennyiségek: 20 pg vegyület vizes metanolban oldva (2 mg1 ml) Az A/16686 antibiotikum Rf értékeit különböző vékonyrétegkromatográfiás rendszerekben mérve a VIII. táblázatban adjuk meg (a körülményeket a táblázatban tüntetjük fel). VIII. táblázat Eluáló rendszer (tf/tf/tf) Rf értékek 1. n-propanol : n-butanol : 1 n ammoniumhidroxid 2:3:4 arányú elegy (felső fázis) 0,15 2. n-butanol : ecetsav : víz 4:2:5 arányú elegye 0,61 3. n-butanol : etanol : 0,1 n HC1 elegye 0,61 4. kloroform : etanol : 10%-os ecetsav 4:7:2 arányú elegye 0,00 (A táblázat folytatása) Eluáló rendszer (tf/tf/tf) Rf értékek 5. n-butanol : ecetsav : víz 4:1:5 arányú elegye 0,17 6. metanol : 10%-os vizes ammóniumacetát : 10%-os ammóniumhidroxid 10:9:1 arányú elegye 0,52 7. n-butanol : piridin : víz : ecetsav 6:4:3:1 arányú elegy 0,45 8. metanol : 10%-os vizes ammóniumacetát : 10%-os vizes ammóniumhidroxid 10:9:1 arányú elegy 0,11 9.0,5 mólos vizes NaH2P04 : acetonitril 1:1 arányú elegy 0,68 10. metanol : 10%-os vizes ammóniumacetát 1:1 arányú elegy 0,65 11.n-butanol:ecetsav:víz 4:2:5 arányú elegy 0,77 Rm: körülbelül 140 mm Mennyiségek: a vegyület 1:1 arányú acetonitril/víz-eleggyel készített oldatának (1 mg/ml) 2—5 pl-re Előhívás: a) bioatográfia agar lapokon B. subtilis ATCC 6633-al beoltva; b) karbonizálás a-naftol-kénsawal hevítve; c) jódgőz; d) klór-toluidin reagens; e) UV-fény 254 nm-nél 1—7. Silicagel 60 F254 lapok (Merck); előhívás a, e b, c, d, e 8, 9. Silicagel 60 F254 szilánozott (Merck); előhívás e 10,11. Cellulose F lapok (Merck); előhívás a, Ahogy nagyteljesítményű kromatográfiás módszerekkel való meghatározások mutatják, az A/16686 antibiotikum, a 3. példában leírt elkülönítés és tisztítás után, egy főkomponenst tartalmaz, amely 70—80%-ot tesz ki, és a fennmaradó 30—20%-ot legalább két kisebb komponens alkotja. Az előző példákban leírt módon izolált (/16686-hidroklorid egy klórtartalmú bázikus glikopeptid hidrokloridja, amely abban különbözik a klasszikus glikopeptid-csoporttól, hogy klórt tartalmaz, továbbá abban tér el, hogy számos aminosav-komponenst foglal magában. Valójában az A/16686 antibiotikum aminosav-analízise 6 n hidrogénklorid-oldatban 110 C°-on 6 óra hosszat történő hidrolizis után, aminosav-autoanalizátorral meghatározva, a következő aminosavak jelenlétét mutatja: ornitin (118 pg/ mg=0,58 pM/mg), aszparaginsav (29,2 pg/mg=0,22 pM/ mg), treonin (68 pg/mg=0,57 pM/mg), glicin (25 pg/ mg=0,33 pM/mg), alanin (29 pg/mg=0,32pM/mg), leucin (41 pg/mg=0,31 pM/mg) és fenilalanin (42 pg/ mg=0,25 pM/mg). További négy csúcsot határoztunk meg semleges és savas aminosavak meghatározására szolgáló oszlopon. A négy aminosav közül kettőt gázkromatográfiás — tömegspektrometriás méréssel határoztunk meg a megfelelő metilészter-trifluoracetil-származékokká való alakítás után és a szerkezetük az I, illetve a II képletnek felel meg. 4. példa A szabad bázis elkülönítése 0,05 g A/16686 antibiotikum 3 ml víz és 8 ml etanol elegyével készített oldatát 2 ml 1,2-epoxibutánnal kezeljük. Az elegyet 1 napig állni hagyjuk alacsony hőmérsékleten, ekkor 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
