181505. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 21-hidroxi-20- metil-pregnán- származékok előállítására
3 181505 4-etanolban, dimetil-formamidban vagy dimetil-szulfoxidban) oldva erős keverés közben szétporlasztjuk (előnyösen lágyított) vízben, amely szokásos emulgeálószereket tartalmaz. Alkalmas emulgeálószerek nemionos emulgeátorok, így például poliglikolok etilén-oxid adduktumai vagy zsírsavészterei. Alkalmas emulgeátorokként a Tegin ®, Tagat ®, Tween ® és Span ® márkanevű forgalomban lévő nedvesitőszerek említhetők. A fermentációnál a szubsztrát emulgeálása gyakran fokozottabb szubsztrátátvitelt tesz lehetővé, így ez a szubsztrátkoncentráció emelésének felel meg. Magától értetődően az is lehetséges, hogy a találmány szerinti eljárásnál a szubsztrátátvitel fokozására más módszereket is alkalmazhatunk, amelyeket a fermentációs szakemberek jól ismernek. Az optimális szubsztrátkoncentráció, szubsztrátadagolási idő és fermentációs időtartam az alkalmazott szubsztrát szerkezetétől függ. Ezeket az értékeket, ahogy ez mikrobiológiai szteroidátalakítások esetében általában szokásos, az egyes esetekben előkísérletekkel kell megállapítani, amint ez a szakember előtt ismeretes. Az eljárás szerinti termékek előállítása tovább javítható, ha a Mycobacterium törzseket szokásos módon szelektáljuk vagy mutációkra késztetjük. így például Mycobacterium spec. NRRL B—3805-t széleszthetünk — célszerűen mutagénekkel történt kezelés után — vér-agar lemezeken, és így különböző morfológiai kinézésű egysejt-telepeket kaphatunk. Ha ezeket az egysejt-telepeket elkülönítjük, és megvizsgáljuk az (I) általános képletű 21 -hidroxi-20-metil-pregnán-száimazékokat termeld képességűket, úgy azt találjuk, hogy különösen olyan törzsek között, amelyek kerek telepeket képeznek, gyakran találunk olyan törzseket, amelyek 1,5—3-szor magasabb hozammal termelnek 2 l-hidroxi-20-metil-pregnán-származékokat, mint a nem szelektált törzs. Az (I) általános képletű 21-hidroxi-20-metil-pregnán-származékok értékes köztitermékek gyógyszerhatású szteroidok szintéziséhez. így például ezeket a vegyületeket a (III) általános képletű megfelelő pregnán-20-karbonsavakká lehet oxidálni, amelyek a H. Ruschig és munkatársai által leírt eljárás szerint [Chem. Bér. 88. (1955)] a (IV) általános képletű — ahol Y jelentése hidrogénatom vagy 17a-helyzetű hidroxilcsoport — pregnán-3,20-dion-származékokká alakíthatók át. Az így nyerhető vegyületek különösen sárgatesthormon hatásukkal tűnnek ki, és ezért értékes köztitermékek számos gyógyászatiig hatásos szteroid szintéziséhez. A következő példák a találmány részletesebb magyarázatául szolgálnak. 1 1. példa a) Egy 2 literes Erlenmeyer lombikban 500 ml steril táptalajt — amely 1% élesztőkivonatot, 0,45% dinátrium-hidrogén-foszfátot, 0,34% kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,2% Tagat ® 02-tartalmaz, és a pH-ja 6,7-re van beállítva — beoltunk Mycobacterium spec. NRRL B—3805 száraz tenyészet vizes rázadékával, és percenkénti 190 fordulattal 3 napig rázatjuk 30 *C-on. b) 22 g szitoszterint 4,4 g Tegin®-nal és 430 ml vízzel 95 *C-on 25 percig emulgeálunk egy Jahnke und Kunkel gyártmányú Ultra-Turrax®-szal, és végül vízzel 513 g-ra feltöltjük. Az emulziót 20 percig sterilezzük 120 *C-on. c) Egy 500 ml-es Erlenmeyer lombikban 65 ml steril táptalajt — amely 2 g kukoricalekvárt, 0,3 g diammónium-hidrogén-foszfátot, 0,25 g Tagat® 02-tartalmaz, és pH-ja 6,5-re van beállítva — beoltunk 5 ml Mycobacterium spec, oltótenyészettel. Utána hozzáadunk 28 ml-t az lb szerint készített szuszpenzióból (ez 1,2 g szitoszterinnek felel meg), majd 24 óra múlva 4 ml 4%-os vizes nátrium-tetraborát oldatot adunk hozzá, és további 120 órán át 30 'C-on rázatva fermentáljuk. A fermentáció elvégzése után a fermentlevet 2x100 ml 1,2-diklór-etánnal extraháljuk. Az egyesített diklór-etános extraktumokat utána 11 g aktívszénnel elegyítjük, és redős szűrőn megszüljük. A szűrletet végül 40 'C-on rotációs bepárlón bepároljuk, és alumínium-oxidon kromatografáljuk. A kromatografálás után 135 mg21-hidroxi-20-metil-4-pregnán-3-ont kapunk, amelynek olvadáspontja etil-acetátból végzett átkristályosítás után 140—141 'C. Ha a reakciót ugyanilyen körülmények között végezzük, de nátrium-tetraborát oldat hozzáadása nélkül, úgy 45 mg 21 -hidroxi-20-metil-4-pregnán-3-ont kapunk. 2. példa a) 22 g 4-kolesztén-3-onból az lb példában leírtak szerint 513 g emulziót készítünk. b) Az le példában leírt körülmények között 70 ml Mycobacterium spec. NRRL B—3805 tenyészetet készítünk, amelyet 28 ml 4-kolesztén-3-on emulzióval, és 24 óra múlva 4 ml 4%-os vizes nátrium-tetraborát oldattal elegyítünk, és további 120 órán rázatás közben 30 'C-on fermentáljuk. A fermentlevet az le példában leírtak szerint feldolgozzuk, és így 95 mg 21-hidroxi-20-metil-4-pregnén-3-ont kapunk, amelynek olvadáspontja 142—144 'C. Ha a reakciót ugyanilyen körülmények között végezzük, de nátrium-tetraborát oldat hozzáadása nélkül, úgy 40 mg 21 -hidroxi-20-metil-4-pregnén-3-ont kapunk. 3. példa 28 ml lb példa szerint készített szitoszterin-emulziót az le példában leírtakhoz hasonlóan fermentálunk 70 ml Mycobacterium spec. NRRL B—3805 tenyészettel, de a vizes nátrium-tetraborát oldat helyett 6 ml 4%-os vizes kalciummetaborát szuszpenziót adunk hozzá. A fermentlé le példában leírtak szerint végzett feldolgozása után 120 mg 21-hidroxi-20-metil-4-pregnén-3-ont kapunk, amelynek olvadáspontja 141—143 'C. 4. példa 28 ml lb példa szerint készített szitoszterin-emulziót az le példában leírtakhoz hasonlóan fermentálunk 70 ml Mycobacterium spec. NRRL B—3805 tenyészettel, de a vizes nátrium-tetraborát oldat helyett 5 ml 4%-os trifenil-borát oldatot adunk hozzá. A fermentlé le példában leírtak szerinti feldolgozása után 125 mg 21-hidroxi-20-metil-4-pregnén-3-ont kapunk, amelynek olvadáspontja 142—143 'C. 5. példa a) Az la példa körülményei között Mycobacterium spec. NRRL B—3683 tenyészetet készítünk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2.
