181343. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ivarspecifikus sperma előállítására mesterséges termékenyítéshez
3 181343 4 tára irányult (Becze, Magyar Állatorvosok Lapja, 1966., 1., 24-26.). A vizsgálatok kimutatták, hogy az X és az Y kromoszómájú spermiumok között morfológiai, fajsúlybeli, mozgáskészségbeli, fiziológiai, biokémiai és fluorescens különbségek vannak. A morfológiai különbségek vizsgálata során kitűnt, hogy a sertés, a ló és a szarvasmarha spermiumainak fejméretére vonatkozó eloszlási görbe mindig két csúccsal rendelkezik. (Thormálen: Diss. Hannover, Heft 69., 1973.). Ezt a nagyságbeli dimorfizmust humán spermiummal (Shettles, Nature, London, 1960, 187, 254-255 és Fertil. Steril., 1961., 12., 502-507.), valamint kos, bika és nyúl spermiummal (Vladimirskaja, Petrenko, Anim. Breed. Abstr., 1970., 39, 311.) mások is igazolták. Vizsgálatokat végeztek továbbá a spermiumok frakcionált szétválasztásával.Nyúl és bika spermiummal végzett ülepítési vizsgálatok szerint a felső frakcióban a kisebb fejméretű Y kromoszómájú, az alsó frakcióban a nagyobb fejméretű X kromoszómájú spermiumok voltak túlsúlyban. (Bhattacharya: Z. Wiss. Zool., 1962., 166., 203-250.; Kranjc: Vet. med. Diss., Hannover, 1964.). A fentiekben ismertetett dimorfizmus alapján feltételezték, hogy az eltérő kromoszómájú spermiumok különböző fajsúlyúak. Ez a feltételezés igazolódott, bár a különbség csekély. A fajsúlykülönbség alapján a nehezebb alsó frakcióban 70% nőivarú, a könnyebb felső frakcióban 63,9% hímivarú spermium arány volt elérhető (Schilling, Der Tierzüchter, 1966., 18., 4.). Az ondósejtek mozgáskészségbeli tulajdonságainak vizsgálata alapján megállapítást nyert, hogy az Y kromoszómájú spermium mozgékonyabb. Ennek alapján, késletetett inszeminálással sikerül 65% hímivarú arányt elérni, de a vemhesülési arány romlott. A kétféle spermium fiziológiai különbségére vonatkozó vizsgálatok során vizsgálták a különböző nemi hormonokkal és biostimulátorokkal, valamint különböző kémiai anyagokkal végzett kezelések hatását. A vizsgálati eredmények azonban nem szignifikánsak, nem reprodukálhatók és esetenként ellentmondóak. Hasonlóképpen nem vezetett eredményre az elektroforézises szétválasztás sem, amellyel ugyan nyúl spermium esetében 78-80%-os ivararány volt elérhető, de az eljárás bikaspermium esetében hatástalannak mutatkozott. A gyakorlatban ugyancsak nem mutatkozott eredményesnek és nem volt reprodukálható az a módszer sem, amelynél a spermákat a szétválasztás érdekében hígítatlan, vagy hígított állapotban elektrosztatikus és mágneses tér hatásának tették ki. (DD 100 380 lajstromszámú szabadalmi leírás). Á morfológiai különbségekkel egybehangzó eredményre vezettek a sperma biokémiai összetételével kapcsolatos vizsgálatok. Megállapítást nyert, hogy a különböző kromoszómájú spermiumok DNS, aminosav és nitrogén, vagyis szárazanyag tartalma különböző, ami a fajsúlykülönbséget támasztja alá. 2 A kétféle spermium morfológiai különbségei alapján megkísérelték a centrifugálással való szétválasztást, de ez a módszer az ondósejtek vitalitására és termékenyítő képességére gyakorolt rendkívül kedvezőtlen hatása miatt nem vált be. A spermiumok épségének megőrzése és a kedvező ivararány eltolódás szempontjából a legnagyobb érdeklődést az ülepítés (szedimentáció) váltotta ki. E módszer egyik legfontosabb kérdésének a megfelelő hígítószer, másik kérdésének az ülepítési idő és az ülepítés alatti hőmérséklet meghatározása bizonyult. A kezdetben alkalmazott nagy viszkozitású hígítók a sperma termékenyítő képességét erősen csökkentették és bár az így elért ivararány esetenként kedvező volt, a vemhesülés 20%-ra csökkent. (Bhattacharya, i.m.) Tízszer kisebb viszkozitású hígítószer alkalmazásával az eredményeket sikerült javítani (Schilling, Tierzüchter, 1972., 24., 714- -715., Knaack: Fortpfl. Haust. 1968., 4., 249- —255., 256—269., 279—282., Vladimirskaja, Petrenko, i.m.). Az eltérő eredmények ellenére megállapítható volt, hogy ez a módszer ígéri leginkább a gyakorlatban alkalmazható ivarspecifikus termékenyítés lehetőségét. Végeredményben a szakirodalom alapján megállapítható, hogy az ivarspecifikus sperma előállítására vonatkozó olyan módszer, amely egyértelműen elfogadható, nagyüzemileg biztonságosan alkalmazható, minden körülmények között egyértelműen reprodukálható és a mesterséges termékenyítési hálózatok nagyüzemi, mélyhűtéses technológiájába zökkenésmentesen beilleszthető lenne, eddig még nem alakult ki. A találmány célja ivarspecifikus sperma előállítására és alkalmazására vonatkozó olyan eljárás kidolgozása, amely a mesterséges termékenyítés nagyüzemi, mélyhűtéses technológiájába a technológia folyamatosságának megszakítása nélkül, zökkenőmentesen beilleszthető, a sperma vitalitását és termékenyítő képességét a legkevésbé károsítja, végül ivari determinációja nem rosszabb, mint 60 : 40%. A találmány azon a felismerésen alapul, hogy van olyan ülepítési és olyan frakcionálási módszer, amely a kétféle spermium-frakció különbségét élesebbé teszi. Felismertük továbbá, hogy az X és az Y kromoszómájú spermiumok közötti morfológiai különbségek még az azonos fajtájú hímivarú egyebek termékenyítőanyagánál sem egyformák; vannak olyan hímivarú egyedek, amelyek kétféle spermiuma közötti különbség szignifikánsabb és így a szétválasztásuk lehetősége lényegesen kedvezőbb. Találmányunk szerint az ülepítést oly módon végezzük, hogy a sperma hígításához használt hígítószer felét az ülepítő oszlopba töltjük és az equilibrációs hőmérsékletre hűtjük. A spermát a hígítószer másik felével a kívánt hígítás 50%-ára hígítjuk, az equilibrációs hőmérsékletre lehűtjük és ezt az ülepítő oszlopba, a tiszta hígítószer fölé elegyedés nélkül rárétegezzük. Az ülepítés befejezése után a frakcionálást egy erre a célra alkalmasan kialakított pipettával végezzük; az elegy felső rétegét 5 10 15 2C 25 30 35 40 45 50 55 60 65
