181343. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ivarspecifikus sperma előállítására mesterséges termékenyítéshez
5 181343 6 használjuk fel hímivarspecifikus inszeminálásra, a középső réteget indifferensnek tekintjük, míg a nőivarspecifíkus inszeminálásra az alsó réteget alkalmazzuk. Az ülepítésre és frakcionálásra olyan hímivarú egyedek spermáját használjuk, amelyekre a kétféle spermium közötti különbség szignifikanciája előzetes vizsgálattal megállapítást nyert. Ehhez a frakcionált sperma mikroszkópos vizsgálatát is elvégezzük a morfológiai különbségek megállapítása céljából, amelyek az egyes sejtfrakciók között - a hímivarú egyedtől függően — eltérők lehetnek. A találmány szerinti eljárás lényege tehát, hogy az ivardeterminációhoz szelektált hímivarú egyed spermáját az önmagában ismert hígítószer szokásos mennyiségének egy részével elegyítjük. A hígítószer fennmaradó másik részét ülepítő oszlopba töltjük és a hígított spermát erre rétegezzük. A hígító viszkozitásához adaptált ülepítési idő eltelte után az elegyet a felhasználás szempontjából legalább három frakcióra osztjuk. A frakciók közül a könnyebb, célszerűen a legfelsőbb frakciót hímivarspecifikus, a nehezebbet, előnyösen a legalsót nőivarspecifíkus inszeminálásra használjuk fel. A legmegfelelőbb hímivarú egyedeket oly módon választjuk ki, hogy az utódellenőrzési ciklusban az utódcsoportok létrehozásához vett spermából ivarspecifikus spermát állítunk elő és ezzel ivadékvizsgálatra szolgáló ivardeterminációs termékenyítéseket végzünk. A hímivarú egyedeket az ivardeterminációs termékenyítéshez, a termékenyítő anyag előállításához azok közül választjuk ki, amelyek utódainál 60%-ot meghaladó ivararány mutatkozik a kívánt ivar javára. Bika ivarspecifikus spermájának előállításához a spermát a szokásos, a technológiai előiratban meghatározott mennyiségű hígítószer 50%-ával elegyítjük és ezt az elegyet ülepítő oszlopban hasonló mennyiségű hígítószer fölé rétegezzük. Mintegy 60—80 perc ülepedési idő eltelte után az elegy felső harmadát használjuk fel hímivarspecifikus, az alsó harmadát nőivarspecifíkus inszeminálásra. Az egyes frakciókat felfelé irányított szájnyílású csővel vesszük le. Annak érdekében, hogy — a megfelelő hímivarú egyedek kiválasztása során - a vizsgálati adatok és eredmények tévedésmentessége biztosítva legyen, az ülepítő oszlopból kivett háromféle ivarspecifikus sperma közül csak az egyiket használjuk fel inszeminálásra. A találmány szerinti eljárás példaképpeni foganatosítási módjait szarvasmarha ivardeterminációs mesterséges termékenyítésével kapcsolatban ismertetjük, habár az eljárás más emlős gazdasági haszonállatok szaporítása során is hasonló módon alkalmazható. 1. példa Az inszemináláshoz kiválasztott bika spermavételét, ennek minősítését, hígítását és hűtését a termékenyítő állomáson folytatott technológia szerint végezzük. Hígítószer gyanánt az önmagában ismert háromféle hígító valamelyikét használjuk; ezek megnevezése és relatív viszkozitása + 4 C-on (víz = 1): Laiciphos plus 470 1,05135 TRIS 1,05405 Jondet 1,05670 A spermát a termékenyítő állomás technológiájában előírt, a példa szerinti esetben négyszeres, teljes hígítószer mennyiség felével elegyítjük. Az ülepítést 5 ml űrtartalmú kémcsőben, mint ülepítő oszlopban végezzük. A kémcsöveket + 4 °C hőmérsékletű vízfürdőben tartjuk. Az egyes kémcsöveket félig hígítószerrel töltjük, majd erre, előre lehűtött pipettával és lehetőleg keveredésmentesen rárétegezzük a hígítószerrel elegyített spermát, ezáltal a kémcsövet teljesen feltöltve. Az ülepítést 60-80 percen át végezzük. Ez alatt az oszlop sejtállománya kiegyenlítődik és biztosítható az inszemináláshoz alkalmazott 0,25 ml-es műszalma egy adagjában 10—15 millió jól mozgó spermium jelenléte. Az ülepítés befejezése után felfelé hajlított végű pipettával, amelynek szájnyílása felfelé néz, leszívjuk a folyadék Y kroinoszómájú spermiumokban dús felső harmadát, majd ugyanúgy a középső harmadát; visszamarad az X kromoszómájú spermákban dús alsó harmad. A felső frakció MA (masculinum), az alsó frakció FE (femininum) megjelöléssel próbahűtésre kerül; ha a felolvasztás után az élő és jól mozgó spermiumok %-os aránya és a térfogategységre vonatkoztatott abszolút mennyisége megfelelő, 0,25 ml-es adagokban a felhasználás helyére kerül. A két frakció mikroszkópos vizsgálatai egy magyartarka bika (3231. számú Sanyi) spermiumaival kapcsolatban azt mutatták, hogy a spermiumok fejszélessége az MA frakcióban 3,6 és 5,8 mikrométeres határok között átlagosan 4,69, az FE frakcióban 4,1 és 6,0 határok között átlagosan 5,04 mikrométer, míg a spermiumok fejhosszúsága az MA frakcióban 7,5 és 10,2 között átlagosan 8,92, az FE frakcióban 7,9 és 10,5 között átlagosan 9,31 mikrométer volt. A kétféle frakcióban levő spermiumok morfológiai különbsége tehát jelentős, a fejtérfogatok különbsége mintegy 20%. 2. példa Ivardeterminációs mesterséges termékenyítést végeztünk hét véletlenszerűen kiválasztott bikával (1. táblázat). Az A és B jelű bikák esetében mind hímivarspecifikus (MA), mind nőivarspecifíkus (FE) frakcióval, míg a C—G jelű bikák esetében csak nőivarspecifíkus (FE) frakcióval végeztünk inszeminálást. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaltuk össze. A 2. táblázatból kitűnik, hogy az ivardeterminációs termékenyítéshez nem alkalmas két utolsó (F, G) bikától eltekintve, az első öt (A-E) bikára vonatkozó átlagos ivararány a nőivarú utódoknál 64,7%, vagyis megközelíti az optimális átlagnak tekinthető 65 : 35%-os ivararányt. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
