181089. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens enzimszubsztrátok enzimatikus meghatározására
3 181089 4 nek jelen, amikor a tulajdonképpeni ismeretlen mintát adjuk hozzá. Másrészt nem is túl sok szubsztrátot adunk hozzá, hogy a tulajdonképpeni mérőreakcióra ne kapjunk túl magas és a mérőreakció pontosságát negatívan befolyásoló nulla értéket. Az utóbbi játszik például szerepet egy eljárás szerint képződő színezék fotometriás méréseinél. Az ilyen, egy reakciótermékként keletkező színezék fotometriás meghatározásán alapuló módszerek esetében a hozzáadott meghatározott szubsztrátmennyiséget olyan alacsonyan tartjuk, hogy még ne keletkezzen zavaró koncentrációjú színezék. Ez a gyakorlatban minden esetben könnyen elérhető, mivel ilyenfajta színezék vagy egyéb indikátortennék csak olyan szubsztrátmennyiségből keletkezik, amely zavaró anyagok elreagáltatásához szükséges szubsztrátmennyiséget meghaladja. A találmány szerinti eljárásnál nem szükséges a zavaró idegen anyagok fajtáját ismerni. Főként redukáló anyagokról van szó, de oxidáló vagy egyéb zavaró anyagok is biztonsággal kiküszöbölhetők a találmány szerinti eljárással. A találmány tárgya továbbá enzimszubsztrát enzimatikus meghatározására szolgáló, a szubsztrát meghatározására alkalmas rendszert tartalmazó reagens, amely legalább egy enzimből, legalább egy pufferanyagból és legalább egy indikátoranyagból valamint adott esetben segédanyagokból áll, és amelyet az jellemez, hogy meghatározott mennyiségű szubsztrátot tartalmaz, az ezen szubsztrát meghatározására szolgáló rendszer szubsztrátmeghatározó kapacitásánál kevesebbet. Ha a száraz formában lévő találmány szerinti reagenst vízben feloldjuk, a zavaró anyagok kiküszöbölésére szolgáló reakció már az oldás alatt és után végbemegy. Az így kapott oldat azután közvetlenül alkalmazható az enzimszubsztrát tulajdonképpeni meghatározására, vagy újra szárazreagenssé alakítható, amely alkalmas későbbi újabb feloldásra a meghatározási reakció kivitelezése előtt. Lehetséges azonban az is, hogy a találmány szerinti reagenst csak közvetlenül felhasználása előtt komplettírozzuk szubsztrát-hozzáadással, vagy alternatív módon a reakció beindításához szükséges anyagot, például az enzimet, vagy többfokozatú enzimes reakció esetén a reakcióhoz szükséges valamely enzimet csak utólag adjuk hozzá. A találmány szerinti reagens egyik előnyös kiviteli alakja szubsztrátként glükózt tartalmaz, és a glükóz szubsztrát meghatározására szolgáló rendszer glükózoxidázból (GOD), peroxidázból (POD), pufferból és ABTS® [2,2’-azino-di(3-etil-benztiazolin-6-szulfonát)] színreagensből áll. Egy ilyenfajta reagens esetén, a szubsztrátmeghatározó rendszer 100 ml vizes oldatára számítva, körülbelül 750-1500 egység, előnyösen 900-1200 egység glükózoxidázt (GOD) használunk körülbelül 100 egység/mg fajlagos aktivitású enzimből. A megfelelő mennyiségek szintén körülbelül 100.egység/mg aktivitású peroxidáz esetében: 10—150, előnyösen 80-120 egység/lOOml használatra kész reagensoldat. A megfelelő koncentrációk ABTS-re: 75-150, előnyösen 90—120 mg/ 100 ml. Pufferként 6,5—7,5 pH-jú, előnyösen 6,8—7,2 pH-jú pufferok jönnek számításba. A koncentráció célszerűen 50 és 200. előnyösen 80—120 mmól/liter közötti. Pufferként nátrium-foszfát puffer [Na2 HP04/NaH2 P04 ] az előnyös. Más alkalmas pufferokra példák: foszfát/trisz puffer, citromsav/trisz puffer, borkősav/trisz puffer és maleinsav/trisz puffer. A koncentrációra és a pH-értékre a fent megadottak érvényesek. Az előzőekben leírt módon összeállított reagens esetén a glükóztartalom célszerűen 0,01-0,05, előnyösen 0,02-0,04 mg/100 ml oldat. Egy glükózmeghatározásra szolgáló, találmány szerinti további előnyös reagens esetében a szubsztrát meghatározására szolgáló rendszer GOD és POD mellett színképző komponensekként 4-amino-fenazont (PAP) és fenolt tartalmaz. Ebben az esetben a használatra kész reagensoldatba 100 ml-enként 3000-5000 egység, előnyösen 3800-4200 egység GOD-t, 50—240 egység, előnyösen 160-200 egység POD-t, valamint 10-20 mg, előnyösen 13—17 mg PAP-t és 120—240 mg, előnyösen 160—200 mg fenolt adunk. Ebben az esetben pufferként a fentebb megadott pH-tartományon belüli kálium-foszfát puffer előnyös. A koncentrációnak célszerűen 150 és 250 mmól/liter, előnyösen 180—220 mmól/liter között kell lennie. Ez a reagens célszerűen 0,05-0,25 mg, előnyösen 0,1—0,2 mg glükózt tartalmaz 100 ml oldatban. A fenti adatok az oldott reagensre vonatkoznak. Hasonló módon azonosak a 100 ml oldat készítéséhez szükséges szárazreagensben lévő mennyiségek. Egy további előnyös reagens szubsztrátként húgysavat tartalmaz, és az ezen szubsztrát meghatározására szolgáló rendszer urikázból, POD-ból, színképzőből és pufferból áll. Színképzőként 2,4- -diklór-fenol és 4-amino-antipirin előnyösek. Egy ilyenfajta reagens célszerű kiviteli formájában 35-45 egység, előnyösen 38—42 egység urikázt tartalmaz 100 ml használatra kész oldatban körülbelül 9 egység/mg fajlagos aktivitású anyagból. A POD mennyisége körülbelül 100 egység/mg fajlagos aktivitású anyagból célszerűen 30—40 egység, előnyösen 33-37 egység 100 ml oldatban. A 2,4-diklór-fenolt, amelyet alkálifémsóként, ammóniumsóként vagy aminnal képzett sóként, előnyösen etil-ammóniumsóként alkalmazunk, célszerűen 150—200 mg, előnyösen 165-180 mg közötti mennyiségben — az etil-ammóniumsóra vonatkoztatva - adjuk 100 ml oldathoz. Ezek a mennyiségi adatok természetesen változnak a kation fajtájától függően. A 4-amino-antipirint (=4-amino-fenazon) célszerűen 150- —250 mg, előnyösen 180-220 mg közötti mennyiségben adjuk 100 ml reagenshez. A pufferanyagnak 8,5-9,5 pH-tartományban, előnyösen 8,7-9,3 pH-tartományban kell pufferolnia. A koncentráció célszerűen 100-200 mmól/liter, előnyösen 130—180 mmól/liter. Előnyös a írisz/citrát puffer, más jól alkalmazható pufferok a trisz/borkősav és a trisz/maleinsav puffer. Ennél a reagensnél a húgysavadalék célszerűen 0,05 és 0,25 mg, előnyösen 0,1—0,2 mg 100 ml-enként, a lítium- vagy a nátriumsóra számítva. A találmány szerinti egyik további előnyös reagens szubsztrátként koleszterint tartalmaz, és az ezen szubsztrát meghatározására szolgáló rendszer koleszterin-észterázból, koleszterin-oxidázból, POD-ból és színképzőből valamint pufferanyagból áll. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
