181089. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens enzimszubsztrátok enzimatikus meghatározására
181089 6 Színképzőként különösen 4-amino-antipirin és fenol keveréke alkalmas. Az egyik célszerű kiviteli alakjában ez a reagens lOOml-enként 15-25 egység, előnyösen 17-23 egység körülbelül 20 egység/mg fajlagos aktivitású 5 koleszterin-észterázt, 20-30 egység, előnyösen 22— -28 egység körülbelül 25 egység/mg fajlagos aktivitású koleszterin-oxidázt, 50-200 egység, előnyösen 130-180 egység körülbelül 100 egység/mg aktivitású POD-t, 15-25 mg, előnyösen 17—23 mg 10 4-amino-antipirint és 40—60 mg, előnyösen 45- —55 mg fenolt tartalmaz. Pufferként valamilyen alkalmas 7—8,5 pH-jú, előnyösen 7,8—8,2 pH-jú pufferanyagot használunk 150 és 250 mmól/liter, előnyösen 180-220 mmól/liter koncentrációban. Kü- 15 lönösen alkalmas a kálium-foszfát puffer, de más pufferanyagok is megfelelők, amelyek a megadott tartományban pufferolnak. Egy ilyenfajta reagens koleszterin-tartalma célszerűen 0,20-0,60 mg, előnyösen 0,30-0,50 mg 100 ml reagensoldatban illetve 20 ilyen reagensoldat készítésére alkalmas szárazreagens-mennyiségben. Magától értetődik, hogy a fentebb megadott előnyös, találmány szerinti reagens-adalék mennyiségek csak az egyes enzimekre megadott fajlagos aktivitású 25 enzimekre vonatkoznak, és helyettesíthetők más aktivitású termékekkel. Látható, hogy a találmány szerint az enzimszubsztrátok enzimatikus meghatározásainál fellépő zavaró reakciók kiküszöbölhetők. Ez lehetővé teszi, hogy kevésbé tiszta reagenseket használjunk, meghosszabbítja azon reagensek eltarthatóságát, amelyeknél a tárolás során zavaró anyagok keletkeznek, és növeli a meghatározások pontosságát. A következő példák a találmányt részletesebben J5 szemléltetik. 1. példa Reagens glükóz ABTS-módszer szerinti meghatá- 40 rozására. 5 Nátrium-foszfát puffer, pH 7,0 Glükózoxidáz (kb. 100 E/mg) Peroxidáz (kb. 100 E/mg) ABTS* Glükóz 100 mmól/liter, 1000 E/100 ml, 45 80 E/100 ml, 100 mg/100 ml, 0,05 mg/100 ml. *2,2’-azino-di(3-etil-benztiazolin-6-szulfon- 50 sav)-diammóniumsó. 2. példa Reagens glükóz GOD-PAP módszer szerinti meg- 55 határozására. Kálium-foszfát puffer, pH 7,1 205 mmól/liter, Glükózoxidáz GOD; 60 kb. 100 E/mg) 4100 E/100 ml, Peroxidáz (POD; kb. 100 E/mg) 190 E/100 ml, PAP (4-amino-fenazon) 19 mg/100 ml, Fenol 200 mg/100 ml, Glükóz 0,2 mg/100 ml. 65 3. példa Reagens koleszterin meghatározására. Kálium-foszfát puffer, pH 7,9 Koleszterin-észteráz (kb. 20 E/mg) Koleszterin-oxidáz (kb. 25 E/mg) Peroxidáz (kb. 100 E/mg) 4-Amino-antipirin Fenol Koleszterin 200 mmól/liter, 22 E/100 ml, 24 E/100 ml, 150 E/100 ml, 21 mg/100 ml, 47 mg/100 ml, 0,4 mg/100 ml 4. példa Reagens húgysavmeghatározáshoz. Trisz/acetát puffer, pH 9,1 Urikáz (kb. 9 E/mg) Peroxidáz (kb. 100 E/mg) 2,4-Diklór-fenol-(etil-ammónium)-só 4-Amino-antipirin Húgysav (lítium- vagy nátrium-só) 150 mmól/liter, 39 E/100 ml, 36 E/100 ml, 170 mg/100 ml, 190 mg/100 ml, 0,16 mg/100 ml. 5 példa összehasonlító glükózmeghatározás. A glükózmeghatározás találmány szerinti javított pontosságának bemutatására a következőképpen járunk el: Két reagensoldatot (A és B) készítünk 1. példa szerinti reagens szükséges mennyiségű vízben való feloldásával. Az (A) oldat esetében azonban a glükóz-adalékot elhagyjuk. A meghatározáshoz 50-től 400 mg/100 ml-ig emelkedő koncentrációjú glükóz-standardsorozatot valamint humán-szérum standard-sorozatot készítünk. Meghatározási körülmények: Hullámhossz: Hg 436 nm. Küvetta: 1 cm rétegvastagság. Inkubációs hőmérséklet: 20—25 °C. A mérés vakpróbával szemben történik kereskedelmi forgalomban lévő fotométerben. A küvettákba a következő oldatokat pipettázzuk: Vakpróba Standard Minta Deszt. víz 0,1 mlHígított standardoldat — 0,1 ml — Fe héij ementesített minta — 0,1 ml Tesztreagens 5,0 ml 5,0 ml 5,0 ml 3
