181009. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az 1-helyzetben szarkozil-,hidroxiacetil- vagy L-alfa-aminooxi propinil csoportot és 8-helyzetben észtercsoportot tartalmazó antagonista hatású angiotenzin-II analógok előállítására
5 181009 6 emelkedett vérnyomás stabilizálódása után adtuk a vizsgálandó anyagokat intravénásán vagy szubkután, vizes fiziológiás, illetve vivő anyagot tartalmazó oldatban. A vérnyomásesést Hgmm-ben értékeltük a kezelés előtti érték %-ában. A statisztikai értékelés Student-féle egymintás „t” teszttel történt a vérnyomás különbségekből. A hatástartam az utolsó még szignifikáns vérnyomásesésig eltelő (p = 5%) időtartamot jelenti. Az eredményeket az alábbi 1. táblázatban foglaltuk össze. A táblázat adataiból látható, hogy az (I) általános képletű angiotenzín-II antagonisták reprezentánsai jelentős vérnyomáscsökkentő hatással bírnak, amiből arra következtethetünk, hogy a C-terminális karboxilcsoport töltése nem feltétlenül szükséges a hatás kifejtéséhez. A hatás mértéke szubkután adagolási mód mellett is jelentős és vivőanyagokat tartalmazó oldatokban a hatás időtartama egyes esetekben a több órát is eléri. Gyógyászatilag felhasználható komplexen a találmány szerinti eljárással készített peptidek oly vegyületei értendők, amelyek bizonyos szerves vagy szervetlen anyagok hozzáadására keletkeznek és a peptideknek elnyújtott hatást biztosítanak. Erre alkalmas szerves vegyületek lehetnek bizonyos zselatinok, karboximetil-cellulózok, alginsav-észterek, polifloretinfoszfátok, aminosav-polimerek és -kopolimerek stb. A szervetlen vegyületek közül bizonyos kétvegyértékű fémek, mint például a cink hidroxidja és nehezen oldódó sói, például foszfátjai jöhetnek számításba. A találmány szerinti peptideket, valamint ezek sóit és komplexeit a szokásos gyógyszerkészítmények formájában használhatjuk fel a gyógyászatban. Az ilyen gyógyszerkészítmények a találmány szerinti vegyületeket enterális vagy parenterális beadásra alkalmas szervetlen vagy szerves vivó'anyag kíséretében tartalmazzák. A gyógyszerkészítmények lehetnek szilárd liofilizátumok is, amikor is vivőanyagként a peptidekkel nem reagáló anyagok, például szénhidrátok jöhetnek tekintetbe, lehetnek továbbá híg vagy tömény szuszpenziók vagy emulziók, amelyek különböző tartósító és stabilizáló segédanyagokat is tartalmazhatnak. A gyógyszerkészítmények felhasználhatók a különböző eredetű hipertenziós állapotok differenciált diagnosztizálására, továbbá terápiásán is, renális eredetű magas vérnyomás normalizálására, hipertenzív krízisek, szekunder szívelégtelenség és más, hipertenzióval járó kóros állapotok gyógykezelésére. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik. A példákban alkalmazott rövidítések a szakirodalomban elfogadott rövidítéseknek felelnek meg [J. Biol. Chem. 247 977 (1972)]. További rövidítések: HOAA a hidroxiecetsavnak, OGly az aminooxi-ecetsavnak, OAla pedig az a-aminooxi-propionsavnak az oxigénatomon illetőleg az amino-nitrogénatomon és a karbonilcsoporton keresztül kapcsolódó acilcsoportját jelenti; Pfp = pentafluorfenil. A vegyületek előállítása során a bepárlásokat mindig Büchi-féle Rotavapor készülékben végeztük. Az olvadáspont-meghatározások Dr. Tottoli-féle (Büchi) készülékben történtek. A vékonyréteg-kromatogrammokat Stahl szerinti készített Kieselgel-6 (Merck) márkanevű szilikagél rétegen készítettük. A ktomatogrammok kifejlesztésére a következő oldószerelegyeket használtuk: ( 1) Etilacetát : PAW = 98 :2 (2) Etilacetát : PAW = 95 : 5 (3) Etilacetát : PAW = 90 : 10 (4) Etilacetát : PAW = 80 : 20 (5) Etilacetát : PAW = 70 : 30 (6) Etilacetát : PAW = 60 : 40 (7) n-Butanol : ecetsav : víz = 4 : 1 : 5 (8) n-Butanol : ecetsav : piridin : víz = 30 :6 :20 : 24 (9) n-Butanol : etilacetát : ecetsav : víz = 1 :1 :1 :1 (10) Etilacetát : PAW = 75 : 25 PAW = piridin : ecetsav : víz = 20 : 6 : 11 A vékonyréteg-kromatogrammok előhívása egyrészt ninhidrinnel, másrészt a klór-tolidin-KJ módszerrel történt. A végtermékek tisztítására az alábbi általános módszert alkalmaztuk: 0,5 g szabad pepiidet 4 ml 0,01 mólos ammónium-acetát pufferben oldunk és az oldatot 0,5 liter karboximetil-cellulóz (CMC-52) oszlopra rétegezzük, amelyet előzőleg a fenti pufferrel egyensúlyba hoztunk. Gradiens keverő vei 1,5 liter 0,01 mólos és 1,5 liter 0,4 mólos ammónium-acetát-oldatokat összekeverve 4,5 és 6,5 közötti pH-gradiens-elúciót alkalmazunk. Az áramlási sebesség 25 ml/óra; 10 ml térfogatú frakciókat fogunk fel. Az oszlopról lejövő eluátumot LKB Uvicord-II segítségével folyamatosan regisztráljuk, majd a kapott görbe alapján a főfrakciót Leybold-Hereus liofilező berendezésbe liofilezzük. Szükség esetén a terméket ugyancsak gradiens - elúció segítségével rekromatografáljuk. 1. példa (Szarkozin1, izoleucin-metilészter8)-angiotenzin-II előállítása 1. lépés Boc-Arg(NC>2)-Val-Tyr(Bzl)-Ile- His(Dnp)-Pro-Ile-OMe 1,36 g (7,5 mmól) Ile-OMe • HC1 30 ml kloroformmal készített oldatához 1,05 ml trietil-amint és 1,90 g (5 mmól) Boc-Pro-OPfp-t adunk. Az oldatot a pH-érték állandó szinten tartása mellett 30 percig állni hagyjuk, majd vízzel, azután 10%-os citromsav - oldattal, végül ismét vízzel kirázzuk, szárítjuk és szárazra pároljuk. A maradékként kapott védett dipeptidet [R^1* =0,8] elkülönítés nélkül 5 ml 8 n dioxános sósav-oldatban oldjuk, 15 perc múlva 20 ml vízmentes étert adunk hozzá, majd bepároljuk. A maradékként kapott szabad dipeptid-hidrokloridot [R|s) = 0,46] azonnal oldjuk 30 ml kloroformban, az oldat pH-értékét trietil-aminnal 8-ra állítjuk be, majd 4,36 g (7,5 mmól) Boc-His(Dnp)-OPfp-t adunk hozzá. Az oldatot a pH-érték állandó szinten tartásával 1 óra hosszat állni hagyjuk, majd 0,83 ml 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
