180787. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cisztein-tartalmú peptidek előállítására
15 180787 16 ja alakjában az etil-acetát-fázisban marad. E fázist 0 C° hőmérsékleten kirázzuk 100 ml I n citromsav-oldattal és 100 pH = 3-as citrát-puffer-oldattal és vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfát fölött szárítjuk. Ezután bepároljuk és a maradékot nagyvákuumban szárítjuk. A terméket további tisztítás céljából éter/petroléterből átkristályosítjuk úgy, hogy az éteres oldatot lassan belecsepegtetjük a petroléterbe. Kitermelés: 44,5 g (50%). Op: 116—128 C° (bomlás közben). [a]o = +25,5° (c = 1, metanolban). Elem-analízis a.C^gH^N 30| r,S összegképlet alapján (molekulasúly: 886,13): számított: C = 66,42%; H = 7,17%; N = 4,74%; talált: C = 66,l %; H = 7,4 %; N = 4,7 %. b,,) H-Cys(Trt)-Thr(Bu')-Ser(Bu‘)-OH-trifluor-acetát 8,8 g (10 millimól) Ddz-Cys(Trt)-Thr(But)-Ser(But)-OH-t szobahőmérsékleten feloldunk 8,75 ml (0,1 mól) trifluorecetsav, 1,75 ml víz és 165 ml metilén-klorid (mintegy 175 ml 5%-os, 1% vizet tartalmazó metilén-kloridos trifluorecetsav) elegyében. Az oldatot 1,5 órán keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd 8,85 ml (0,11 mól) piridinnel semlegesítjük, ezután bepároljuk és a maradékot etil-acetát és víz közötti megosztásnak vetjük alá. Az etil-acetát-fázist kétszer vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfát fölött szárítjuk és bepároljuk. A maradékot feloldjuk kevés éterben és lassan petroléterbe csepegtetjük. Kitermelés: 4,2 g (53%). [a]o = +68,5° (c = 1, metanolban). Elem-analízis a C^H^NjOgS - CF3COOH összegképlet alapján (molekulasúly: 777,9): számított: C = 60,21 %; H = 6,48%; N = 5,40%; S = 4,12%; talált: C = 60,7 %; H = 6,7 %; N = 5,2 %; S = 4,2 %. ö7) Ddz-Cys(Trt)-Cys(Trtj-Thr(Bul)-Ser(Bu'j-OH 5,3 g (6,8 millimól) H-Cys(Trt)-Thr(But)-Ser(But)-OH-trifluor-acetátot és 0,95 g (0,7 millimól) HOBt-t feloldunk 15 ml dimetil-formamidban, az oldathoz 0 C° hőmérsékleten hozzáadunk 0,9 ml (0,7 millimól) N-etil-morfolint és 5,35 g (7 millimól) Ddz-Cys(Trt)-OTcp-t. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 14 órán keresztül keverjük, majd — a tripeptid lereagálása után — bepároljuk. [Ha el nem reagált tripeptid még kimutatható, még hozzá kell adni egy kevés Ddz-Cys(Trt)-OTcp-t]. A maradékot feloldjuk kevés etilacetátban, és az etil-acetát-fázist egymás után mossuk a következő oldatokkal: 10—20 ml telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldat, 7 ml 1 n citromsav-oldat és 10 ml citrát-puflfer-oldat, majd nátrium-klorid-oldattal semlegesre mossuk, vízmentes nátriumszulfát fölött szárítjuk és bepároljuk. A maradékot eldörzsöljük petroléterrel. A terméket további tisztítás céljából éter/petroléterből átkristályosítjuk, vagy diizopropil-éterrel elkeverjük. Az átkristályosítást végezhetjük metanol/vízből is. Kitermelés: 6 g (71%). Op: 118—130 C° (bomlás közben). [a]g = + 11,6° (c = 1, metanolban). Elem-analízis a C71H82N4OuS2 összegképlet alapján (molekulasúly: 1231,6): számított: C = 69,23%; H = 6,71 %; N = 4,55%; S = 5,21 %; talált: C = 67,2 %; H = 6,3 %; N = 4,l %; S = 5,3 %. A CHN-analízis szerint a termék csak 97%-os tisztaságú. a) H-Cys(S03H)-Cys(S03H)-Thr-Ser-Ile-Cys(S03H)-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys(S03H)-Asn-OH 983 mg (0,34 millimól) H-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(But)--Ser-(Bu‘)-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-Tyr(Bu‘)-Gln-Leu-Glu (Bu'J-Asn-TyrfBu'yCysíTrO-Asn-OBu'-trifluor-acetátot feloldunk 7,5 ml etil-merkaptán és 7,5 ml trifluor-ecetsav elegyében. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 4 órán keresztül keverjük, majd beleöntjük 50 ml dietil-éterbe. A keletkezett csapadékot leszívatjuk, és a szűrőlepényt éterrel mossuk, majd szárítjuk. Kitermelés: 541 mg. SH-peptid. Mivel az MMR-spektrumban még látható egy kisebb tritil-jel, a kapott termék 420 mg-ját a fentiek szerinti ismételt hasításnak vetjük alá. Kitermelés: 506,7 mg SH-peptid. A jobb jellemezhetőség kedvéért az SH-peptidet a következő módon alakítjuk át a cím szerinti S-tetraszulfonáttá: 450 mg fenti SH-peptidet 19,6 ml trisz-(hidroximetil)-aminometán-HCl-puifer-oldatban (0,1 m. pH = 7,19) szuszpendáljuk, majd hozzáadunk 9,16 g karbamidot, 10 percig keverjük, szobahőmérsékleten hozzáadunk 621 mg vízmentes nátrium-szulfátot és 621 mg nátrium-tetrationátot. A kapott tiszta oldatot 3 órán keresztül hagyjuk reagálni szobahőmérsékleten, majd éjszakán át 4 C° hőmérsékletű hűtőszekrénybe helyezzük. Másnap dialízist végzünk ötször 5 liter vízzel, majd liofilizáljuk. Kitermelés: 438,9 mg (mintegy 51%, a védett peptidre és protein-tartalomra vonatkoztatva). [a]p = _51° (c = 1, vízben). Az MMR-spektrum már nem mutat tritil-proton-jelet. A savas elektroforézis során a cím szerinti tetraszulfonát egységesen és valamivel gyorsabban halad mint a megfelelő, humán-inzuiin-A-lánc-tetraszulfonát. Aminosav-analízis a C76H117N19OjQSa összegképlet alapján (molekulasúly: 2177,5): Asp Thr Ser Glu Cys Ile* Leu Tyr számított: 2 1 2 2 4 1 2 2 talált: 2,00 0,96 1,76 1,88 2,73 1,17 2,27 1,98 * ennek 26,5%-a D-allo-Ile. Az aminosav-analízis alapján a peptid proteintartalma mintegy 69%. 8. példa b) A H-Cys-fTrtj-CysjTrtj-Th^Bu'j-Se^Bu'j-Ile-Cys (TrtJ-Ser-Lcu-TyriBu'j-Gln-Leu-GlulOBu'j-Asn-Tyr-(Bu'VCysfrrtj-Asn-OBu'-trifluor-acetát kiindulási anyag előállítása bt) Ddz-CysjTrtj-CysjTrtj-ThrjBu'j-SeríBu'j-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-Tyr(Bu')-Gln-Leu-Glu(OBu')-Asn-Tyr(Bu')-Cys(Trt)-Asn-OBu‘ 16 g (7 millimól) H-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-Tyr(Bul)-Gln-Leu-Glu(OBu‘)-Asn-Cys-Tyr(But)-Cys(Trt)-Asn-OBu'-trifluor-acetátot, 9,5 g (7,7 millimól) Ddz-Cys(Trt)-Cys(Trt)-ThríBu'J-SeríBu^-OH-t és 1,04 g (7,7 millimól) HOBt-t és 0,9 ml (7 millimól) N-etil-morfolint feloldunk 70 ml 1:1 arányú dimetil-formamid-dimetil-acetamid-elegyben és 0 C° hőmérsékleten hozzáadunk 1,7 g (8,25 millimól) DCC-t. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
