180787. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cisztein-tartalmú peptidek előállítására
17 180787 18 A reakcióelegyet 2 órán keresztül 0 C° hőmérsékleten, majd szobahőmérsékleten keverjük. Éjszakán át állni hagyjuk, majd másnap 5 órán keresztül szobahőmérsékleten még egyszer keverjük. A kivált diciklohexil-karbamidot leszívatjuk. A szűrletet nagyvákuumban felére bepároljuk, majd keverés közben jeges vizbe csepegtetjük. A keletkezett csapadékot leszívatjuk és a következő oldatokkal mossuk egymás után: nátrium-hidrogén-karbonát-oldat, pH = 3-as citrát-pufferoldat, nátrium-hidrogén-karbonát-oldat és víz, majd foszfor-pentoxid fölött szárítjuk. A terméket további tisztítás céljából 100 ml etil-acetáttal — melegítés közben eldörzsöljük. Ezután hozzáadunk 200 ml étert, a csapadékot még melegen leszívatjuk és szárítjuk. A kapott anyagot 220 ml 50%-os vizes metanollal és végül 200 ml metanollal hevítjük és mindkét esetben forrón leszívatjuk. Kitermelés: 19,42 g (81%). Op: 250--260 C° (bomlás közben). [a]o = — 14,2° (c= 1, dimetil-formamidban). Elem-analízis a C188H23sNlg031S4 ■ 2 H20 összegképlet alapján (molekulasúly: 3421,4): számított: C = 66,00%; H = 7,04%; N = 7,78%; S = 3,75%; talált: C = 65,4 %; H = 7,l %; N = 8,0 %; S = 3,8 %. Aminosav-analízis (a cisztein oxidációja után ciszteinsavvá) a fenti összegképlet alapján: Asp Thr Ser Glu Cys Ile Leu Tyr számított: 2 12 2 4 12 2 talált: 1,99 0,89 1,69 1,92 3,97 0,87 2,07 — A Tyr hiányzik, mivel az oxidáció során elbomlik. b2) H-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(Bu')-Ser(Buj-Ile-Cys(Trt)-Ser-Leu-TyríBu'j-Gln-Leu-GlujOBu'j-Asn-TyrtBu1)-Cys(Trt)-Asn-OBu'-trifluor-acetát 10,26 g (3 millimól) Ddz-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(Bu')-SerjBu'j-Ile-CysjTrtj-Ser-Leu-TyríBu'j-Gln-Leu-Glu (OBu')-Asn-Tyr(Bul)-Cys(Trt)-Asn-OBu'-t keverés közben feloldunk 5,25 ml (60 millimól) trifluor-ecetsav 105 ml víz és 99 ml metilén-klorid (mintegy 105 ml 5%-os, 1% vizet tartalmazó metilén-kloridos trifluor-ecetsav-oldat) és 10,5 ml anizol elegyében. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 4 órán keresztül keverjük, majd hozzáadunk 10,5 ml piridint és bepároljuk. Ezután nagyvákuumban desztilláljuk. Az olajos maradékot éterrel eldörzsöíjük, a csapadékot leszívatjuk és szárítjuk. A kapott anyagot ezután vízzel mossuk és foszforpentoxid fölött szárítjuk. További tisztítás céljából az anyagot háromszor 100— 100 ml etil-acetáttal felforraljuk és mindegyik esetben forrón leszívatjuk. Kitermelés: 7,96 g (81%). Op: 240—245 C° (bomlás közben). [o]q = - 10,0“ (c= 1. dimetil-formamidban). Aminosav-analízis a C176H221N19021S4 • CF3COOH öszszegképlet alapján (molekulasúly: 3277,5): Asp Thr Ser Glu Cys Ile Leu Tyr számított: 2 12 2 4 12 2 talált: 1,96 0,80 1,49 2,03 3,21 1,10 2,04 1,78. aj H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys(S03H)-Cys(S03H)-Thr-Ser-Ile-Cys(S03H)-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys(S03H)-Asn-OH ( = humán-inzulin-A-Iánc-tetraszulfonát) 772 mg (0,2 millimól) H-Gly-Ile-Val-Glu(OBu j-Gln-Cys(T rt)-Cys(T rt)-Thr(But)-Ser(Bu‘)-Ile-Cys(T rt)-Ser-Leu-Tyr(Bu')-Gln-Leu-Glu(OBu')-Asn-Tyr(Buj-Cys(Trt)-Asn-OBu1. CF3COOH-t 5 ml etil-merkaptán és 5 ml trifluorecetsav elegyében szuszpendálunk, majd szobahőmérsékleten 4 órán keresztül keverjük és utána beleöntjük 50 ml éterbe. A kivált csapadékot leszívatjuk és éterrel mossuk. Kitermelés: 542 mg. E fenti hasítási műveletet megismételjük az egész 542 mgnyi anyaggal. Kitermelés: 385,9 mg. 80%-os protein-tartalom esetében ez megfelel mintegy 65%-os kitermelésnek. Összegképlet: C9gH155N25035S4. Molekulasúly: 2383,8. Azonosítás céljából 360 mg-nyi anyagból a 8aj. példával analóg módon előállítjuk a cím szerinti tetraszulfonátot. Kitermelés: 370,8 mg (mintegy 60% a védett inzulin-A-láncra vonatkoztatva). [ü]d = —72,9° (c=l, vízben). Aminosav-analízis a CggH155N25047S8 összegképlet alapján (molekulasúly: 2704): 9. példa: számíAsp Thr Ser Glu Gly Cys Val Ile Leu Tyr tott: 2 1 2 4 1 4 1 2 2 2 talált: 1,84 0,90 1.62 4,04 0,94 3,48 0,89 1,81* 2,2 2,2 * 0,44 D-allo-Ile és 1,37 Ile összegéből adódik. bj A H-Gly-IIe-Val-Glu(OBu')-Gln-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(Bu')-Ser(Bu')-Ile-Cys(T rt)-Ser-Leu-T yr(Bu')-Gln-Leu-Glu(OBu')-Asn-Tyr(Bu‘)-Cys(Trt)-Asn-OBu‘-trifluor-acetát kiindulási anyag előállítása b,) Ddz-Val-OTcp 113,3 g (0,334 millimól) Ddz-Val-OH és 65,9 g (0,334 millimól) 2,4,5-tríkIór-fenol 300 ml etil-acetátos oldatához 0 C° hőmérsékleten hozzáadjuk 72,1 g (0,35 millimól) DCC 100 ml etil-acetátos oldatát. A reakcióelegyet 0 C° hőmérsékleten 1 órán keresztül és szobahőmérsékleten 3 órán keresztül keverjük. A kivált diciklohexil-karbamidot leszívatjuk és a szűrletet bepároljuk. A maradékot petroléterrel kristályosítjuk. Kitermelés: 11,45 g (64%). Op: 73—76 C°. [ctJo = —28,7 ° (c= 1, metanolban). Elem-analízis a C23H26N06C13 összegképlet alapján (molekulasúly: 518,84): számított: C = 53,24%; H = 5,05%; N = 2,70%; talált: C=53,5 %; H = 5,2 %; N = 2,9 %. b2) Ddz-Val-Glu(OBu')-OH 30,5 g (150 millimól) H-Glu(OBuj-OH és 20,25 g (150 millimól) HOBt 200 ml dimetil-formamidos oldatához hozzáadunk 19,2 ml (150 millimól) N-etil-morfolint és 77,8 g Ddz-Val-OTcp-t és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 4 órán keresztül keverjük. Ha a vékonyrétegkromatogrammban már nem lehet H-Glu(OBul)-OH-t kimutatni, akkor a reakcióelegyet nagyvákuumban bepároljuk. (Ellenkező esetben még kevés Ddz-Val-OTcp hozzáadásával a reakciót 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
