180783. lajstromszámú szabadalom • Eljárás timozinÓ1(inex lent) és/Asn2(index fölt)/-analógjai előállítására
13 180783 14 juk a reakcióhoz. Az aktív tripeptid-észtert és az undekapeptidet tartalmazó elegyet 2 órán át 0 C°-on, majd 3 napig 25 C°-on keverjük, ezalatt az enyhén lúgos kémhatás biztosítására az elegyhez időről időre Et3N-t adunk. A képződött kocsonyás anyagot 5%-os vizes ecetsavval eldörzsöljük. A kivált fehér, szilárd anyagot leszűrjük, vízzel, metanollal és éterrel mossuk, majd az így kapott 1,28 g nyers terméket (op.: 325^326 C°) 10 ml dimetilformamid és 5 ml dimetilszulfoxid elegyéből 230 ml metanollal kicsapjuk. 1,22 g (80,2%) tiszta Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu-(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 326 -327 C°, [a]2D5= — 15,71° (c= 1, DMF/DMSO). 1,128 g (0,404 mmól), a fentiek szerint előállított terméket 7 ml anizolban 15 percig 0 C°-on 25 ml vízmentes hidrogénfluoriddal reagáltatunk. A sav fölöslegét 0 C°-on lepároljuk, és a kapott maradékot éter és víz között megoszlatjuk. A vizes fázist éterrel kétszer mossuk, eredeti térfogatának felére bepároljuk, és a koncentrátumot fagyasztva szárítjuk. 0,69 g nyers terméket kapunk. A nyers terméket az oktapeptid tisztításánál ismertetett módon kromatografáljuk. A 101— 120. frakciót egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. 0,25 g terméket kapunk, amely csekély mennyiségű szennyezőanyagot is tartalmaz. A terméket ugyanazon az oszlopon ismét kromatografáljuk. 0,155 g (22%) tiszta Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-GIu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-t kapunk, amely papírelektroforézis alapján egységes. [a]25 = -86,27° (c = 1. 0,1 n HC1). B. műveletsor: a) 18,6 g (95,4 mmól) H-Ser(Bzl)-OH 45 ml Triton B-vel készített oldatát szárazra pároljuk. A maradékhoz 11)0 ml dimetilformamidot adunk, és az elegyet bepároljuk. Ezt a műveletet megismételjük. Ezután a maradékhoz 16,9 g (95,4 mmól) AcOSu-t és 150 ml dimetilformamidot adunk, és az elegyet 20 órán át keverjük. Az enyhén lúgos kémhatás biztosítása érdekében az elegyhez időről időre NMM-t adunk. Az oldószert lepároljuk, a terméket etilacetáttal extraháljuk, és az oldatot kevés 10%-os vizes ecetsav-oldattal és vízzel mossuk. A termék vízben oldódik, ezért csak kis mennyiségű vizet használhatunk fel. Az oldatot nátriumszulfát fölött szárítjuk, és szárazra pároljuk. Átlátszó, nem kristályosodó olaj formájában 14,5 g Ac-Ser(Bzl)-OH-t kapunk. A terméket 300 ml metanol és 30 ml víz elegyében oldjuk, az oldathoz 7,0 pH-érték eléréséig 20%-os Cs2C03-oldatot adunk, majd az elegyet bepároljuk. A kapott szilárd sóról kétszer dimetilformamidot párolunk le, majd 15,4 g (91 mmól) benzilbromidot és 250 ml dimetilformamidot adunk hozzá, és az elegyet 18 órán át keverjük. Az oldószert lepároljuk, a maradékot 600 ml vízzel elegyítjük, és a kivált olajos anyagot etilacetáttal kivonjuk. A szerves oldatot vizzel mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és szirupszerű anyag képződéséig bepároljuk. A szirupszerű maradék oltókristállyal kezelve azonnal kristályosodik. A terméket etilacetátból és petroléterből átkristályosítjuk. 10,42 g (32,2%) H3C-CO-Ser(Bzl)-OBzl-t kapunk; op.: 89—91 C°. 2,2 g (6,73 mmól) H3C-CO-Ser(Bzl)-OBzl 75 ml etanollal készített oldatához 5 ml hidrazint adunk, és az elegyet éjszakán át enyhén keverjük. A kivált kevés oldhatatlan anyagot kiszűrjük, és a szűrletet bepároljuk. Az olajos maradékot éteres kezeléssel megszilárdítjuk, és a terméket kevés etanolból és éterből átkristályosítjuk. 1,40 g (82,8%) H3C-CO--Ser(Bzl)-HNNH2-t kapunk; op.: 128—130 C°, [a]^5 + 5,80° (c = 1, metanol). b) 3,57 g (40 mmól) L-alanin 18,8 ml Triton B-vel készített oldatát szárazra pároljuk, és az olajos maradékról 2 x 30 ml dimetilformamidot párolunk le. A kapott sóhoz 11,45 g Boc-Ala-Osu-t (40 mmól), 40 ml dimetilformamidot és 4 ml NMM-t adunk, és az elegyet 20 órán át keverjük. Az oldószert eltávolítjuk, a maradékot 100 ml 10%-os vizes ecetsav-oldatban felvesszük, és a terméket 4 x 100 ml etilacetáttal kivonjuk. A szerves oldatot kevés vízzel kétszer mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, kis térfogatra bepároljuk, és a maradékhoz zavarosodásig petrolétert adunk. Az elegyet éjszakán át hűtőszekrényben tároljuk. Kristályos anyagként 8,2 g (76,3%) Boc-Ala-Ala-OH válik ki; op.: 115 —118C. 36,2 g (139 mmól) Boc-Ala-Ala-OH-t 30 percig 3 liter 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk. Az elegyet bepároljuk, és a maradékot a szokásos módon feldolgozzuk. Az olajos anyagot éteres kezeléssel megszilárdítjuk, és metanol és éter elegyéből átkristályosítjuk. 9,1 g (33,3%) HCL ■ H-Ala-Ala-OH-t kapunk; op.: 209—211 C°. 2,36 g (12 mmól) HC1 • H-Ala-Ala-OH 20 ml dimetilformamiddal készített oldatát jégfürdőn hűtjük, és az oldathoz 1,68 ml (12 mmól) Et3N-t, majd 12 mmól Boc-Asp(OBzl)-OSu-t adunk. Az elegyet 2 órán át 0 C°-on, majd éjszakán át 25 C°-on enyhén keverjük; ezalatt az elegyhez a 8,0 körüli pH-érték biztosítására kis részletekben 12 mmól Et3N-t adunk. Végül az elegyhez néhány ml ecetsavat adunk, és a savas elegyet szárazra pároljuk. A kapott terméket etilacetáttal kivonjuk. A szerves oldatot vízzel háromszor mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és bepároljuk. A kapott 6 g olajos maradékot etilacetátban oldjuk, és az oldat pH-ját DCHA-val 8,0-ra állítjuk. A kivált kristályos sót izopropanolból és petroléterből átkristályosítjuk. 5,1 g (65,7%) Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH ■ DCHA-t kapunk; op.: 138— 141 C°, [a]”= — 13,33° (c= 1, metanol). 3,5 g (5,4 mmól) Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH ■ DCHA-t 500 ml etilacetát és 10 ml 10%-os vizes kénsavoldatot tartalmazó 350 ml víz között megoszlatunk. A vizes fázist 250 ml etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos oldatokat egyesítjük, vízzel kétszer mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és szárazra pároljuk. Üvegszerű, szilárd maradékként 2,5 g Boc-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH-t kapunk. Ezt az anyagot 30 percig 200 ml frissen készített 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezeljük. Az elegyet 32 C°-on sziruppá bepároljuk, és a maradékról kétszer tetrahidrofuránt párolunk le. Az olajos maradékot éteres kezeléssel megszilárdítjuk. Az így kapott 1,93 g (4,83 mmól) HC1 • H-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH-t a következő lépésben azid-módszer szerint H3C-CO-Ser(Bzl)-N3-dal kapcsoljuk. A reagens előállítása során 1,24 g (4,9 mmól) H3C-CO-Ser(Bzl)-HNNH2 25 ml dimetilformamiddal készített, -25 C°-os oldatához 7,42 ml 3,3 n tetrahidrofurános sósavoldatot (24,5 mmól) és 0,99 ml (7,35 mmól) izoamilnitritet adunk, és az elegyet 30 percig - 30 C°-on keverjük. Az így kapott oldatot - 35 C°-ra hűtjük, 4,1 ml Et3N-t adunk hozzá, majd beadagoljuk a fentiek szerint előállított 1,93 g, fehér, porszerű, szilárd HC1 • H-Asp(OBzl)-Ala-Ala-OH-t. Az elegyet 30 percig - 20 C°-on, majd 2 napig 4 C°-on keverjük. Ezalatt az elegyhez az enyhén lúgos kémhatás biztosítására kevés Et3N-t adunk. A reakcióelegyet a szokásos módon feldolgozzuk, és a kapott kristályos anyagot tetrahidrofuránból és petroléterből átkristályosítjuk. 1,85 g (65,6%) H3C-CO-Ser(Bzl)-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
