180746. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-21978 jelű antibiotikum előállítására
27 180746 28 4. példa Az A—21978C komponensek elkülönítése A 3. példában megadottak szerint előállított tisztított A—21978C keverék 2 g-ját 40 ml vízben oldjuk és 4,2 atm nyomáson FMI LAB pumpával (Fluid Metering, Inc., 48 Summit St., Oyster Bay, N. Y., 11771) 4,1 x 60 cm méretű reverz fázisú szilikagél oszlopra töltjük (Quantum LP—1 szilikagél/Cí8), az oszlopot víz, metanol és acetonitril 100 : 15 : 85 arányú, 0,15% ecetsavat és 0,15% piridint tartalmazó elegyével egyensúlyozzuk ki. Az oszlopot körülbelül 4,6 atm nyomáson ezzel az oldószerrel eluáljuk és 25 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. A komponensek eluálódást 280 nm-en végzett ultraibolya fotometrálással és biológiai értékméréssel követjük. Az egyes frakciókat a komponensek tisztaságának vizsgálatára analitikai oszlopon mérjük. Jellemző szeparációs kép a következő: a 33—37. frakciók a C0 komponenst, a 45—53. frakciók a Cj komponenst, a 75—92. frakciók a C2 komponenst, a 112—134. frakciók a C3 komponenst, az 54—74. frakciók a C,, a C2 és C4 komponenseket, végül a 93—111. frakciók a C2, C3 és C5 komponenseket tartalmazzák. A több faktort tartalmazó frakciókat újra visszavezetjük az oszlopra, további tiszta Cj, C2, C3, C4 és C5 előállítására. Az egyetlen komponenst tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, csökkentett nyomáson töményítjük és fagyasztva szárítjuk, amiuíán világos sárga színű, por alakú termékként megkapjuk az egyes komponensek nátrium-sóit. 60 g keverékből az alábbi mennyiségű komponenseket kapjuk: C, = 5,55 g; C2= 10 g; C3 komponens =6,61 g. A több komponenst tartalmazó frakciókat reverz fázisú gyantaoszlopon recirkuláltatjuk, amiután a következő mennyiségű anyagokat kapjuk: C0=550 mg; C, = l,29 g; C2=l,99 g; C3 =443 mg; C4=512 mg és C5 komponens = 384 mg. 5. példa Az A—21978C komponensek elkülönítése és tisztítása nagy méretben Nagy méretekben a komponenseket reverz fázisú oszlopkromátográfiával különítjük el. 6 g, a 3. példában megadottak szerint előállított A—21978C keveréket 80 ml vízben oldjuk. Az oldat pH-ját ecetsavval 4,4-re állítjuk be, majd 20 ml tetrahidrofuránt adunk hozzá. Az oldatot alacsony nyomáson szivattyúval (Lapp Pump) 4,8 x 100 cm méretű acéloszlopra juttatjuk, az oszlop 1,77 1 szilikagél/C18 gyantát (Quantum LP—1, 10—20 mikron, okta-decil-triklór-szilánnal szililált) tartalmaz és víz és tetrahidrof urán 4 : 1 arányú elegyével van kiegyensúlyozva. Az oszlopot 8,5 atm nyomáson 150 ml, víz és tetrahidrofurán 4: 1 arányú elegyével mossuk. Az eluálást víz, metanol, acetonitril 47,5 ; 15 : 37,5 arányú, 0,2% piridint és 0,2% ecetsavat tartalmazó elegyével végezzük, az eluálás sebessége 35 ml/perc. 175 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. Az eluálást folyamatosan ellenőrizzük ultraibolya detektorral 280 nm hullámhosszon. Az egyes komponenseket tartalmazó frakciókat analitikai reverz fázisú gyantaoszlopon még egyszer ellenőrizzük. Az egyetlen komponenst tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és fagyasztva szárítjuk. Jellemző feldolgozás a következő eredményeket adja; a 12—16. frakciók a C0 komponenst tartalmazzák: a 20—26. frakciók aC,;a 38—50. frakciók a C2; a 63— 78. frakciók a C3 komponenst tartalmazzák. A ^ és C4 komponenseket tartalmazó 27- »37. és a C2 és C5 komponenseket tartalmazó 51—62. frakciókat tiszta C4 és C5 komponensek előállítására visszavezetjük az oszlopra. Az oszlop 6—12 g anyag elválasztására képes. 84 g A—21978C keverékből 1,9 g C0, 3,27 g C,, 4,97 g C2 és 1,94 g C3 komponenst kapunk. Az egyes komponenseket jobb kitermeléssel kapjuk meg, ha megfelelő nagynyomású folyadék-kromatográfiás oldószerelegyet használva recirkuláltatjuk a több komponenst tartalmazó frakciókat. A választott oldószerelegy az egyes kísérletektől, a reverz fázisú gyantától és az oszloptól függően változhat. Az A—21978C komponensek elválasztására az alábbi oldószerelegyeket használjuk: A) Analitikai rendszerek Víz, metanol és acetonitril 50 : 15 : 35 arányú, 0,2% ecetsavat tartalmazó elegye, amelynek a pH-ját piridinnel 5,5-re állítjuk be. Víz, metanol és acetonitril 50 : 15 : 35 arányú elegye, amely 0,2% ecetsavat és 0,2% piridint tartalmaz. Víz, metanol és acetonitril 50 : 15 : 35 arányú elegye, amely 0,75% ammónium-formiátot tartalmaz. Víz, metanol és acetonitril 95 : 30 : 75 arányú elegye, amely 0,2% ecetsavat és 0,2% piridint tartalmaz. Víz, metanol és acetonitril 105 : 15 : 80 arányú elegye, amely 0,2% ecetsavat és 0,2% piridint tartalmaz. Víz, metanol és tetrahidrofurán 59 : 15 : 25 arányú elegye, amely 0,5% ecetsavat és 0,5% piridint tartalmaz. Víz, metanol és tetrahidrofurán 60: 15 : 25 arányú elegye, amely 0,5% ammónium-formiátot tartalmaz. B) Preparaífa rendszerek Víz, metanol és acetonitril 95 : 20: 85 arányú elegye, amely 0,5% ecetsavat és 0,15% piridint tartalmaz. Víz, metanol és acetonitril 100: 15 : 85 arányú elegye, amely 0,15% ecetsavat és 0,15% piridint tartalmaz. Víz, metanol és acetonitril 50 : 10 : 40 arányú elegye, amely 0,1% ecetsavat és 0,1% piridint tartalmaz. Víz, metanol és acetonitril 50: 15 : 35 arányú elegye, amely 0,75% ammónium-formiátot tartalmaz. Víz, metanol és acetonitril 55 : 10 : 35 arányú elegye, amely 0,2%, ecetsavat és 0,8% piridint tartalmaz. Víz, metanol és tetrahidrofurán 52,5 : 15 : 32,5 arányú elegye, amely 0,6% ammónium-formiátot tartalmaz. Víz, metanol és tetrahidrofurán 50: 15 : 35 arányú elegye, amely 0,6% ammónium-formiátot tartalmaz. Az ecetsav-piridin elegy előnye az ammónium-formiátot tartalmazó eleggyel szemben az, hogy az előzőt a fagyasztva szárítás közben eltávolíthatjuk, míg az ammónium-formiátot Sephadex G—25 gyantával kivitelezett oszlopkromatográfiával kell eltávolítani. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
