180746. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-21978 jelű antibiotikum előállítására
29 180746 30 6. példa Az A—21978C keverék izolálása (másik módszer) 97 1 teljes fermentlevet, amit az 1. példában megadottak szerint állítottunk elő, 4°/ó Hyflo Super—Cel szűrési segédanyag jelenlétében szűrünk, a kapott 80 1 térfogatú szűrletet 2 órán át 2 1 nem ionos makroporózus sztirol és divinil-benzol kopolimerjével (Diaion HP—20 gyanta, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japán) keverjük. A felülúszót dekantáljuk, a gyantát 8 1 vízzel mossuk, majd ezt követően dekantáljuk a vizet. 8 1 acetonitril és víz 15 : 85 arányú elegyét adjuk a gyantához, majd 15 percen át keverjük. Az oldószert szűréssel elkülönítjük. Ezután az A—21978C keveréket eluáljuk a gyantáról oly módon, hogy egy órán át 8 1 acetonitril és víz 2: 3 arányú elegyével keverjük, majd szűrjük. Ezt az összes A --21978C keverék eltávolítására megismételjük. Egyesítjük a két szűrletet és csökkentett nyomáson olajos desztillációs maradékig töményítjük. Az olajat a lehető legkevesebb vízben oldjuk, melegítés közben 2 térfogat metanolt adunk hozzá, majd az A—21978C keverék kicsapására 30 térfogat acetont adagolunk. A csapadékot szűréssel elkülönítjük és csökkentett nyomású térben szárítjuk, amiután 13,6 g 570 egység/mg biológiai aktivitású nyers A—21978C keveréket kapunk. Az A—21978C nyers keverékét szilikagél oszlopkromatográfiával tisztítjuk. 1 g keveréket a lehető legkisebb mennyiségű vízben oldunk, majd a víz adszorbeálására szilikagélt (Grace 62) adunk az oldathoz. Az adszorbenst acetonitrilben szuszpendáljuk. Ezt a szuszpenziót 1,5 x40 cm méretű szilikagélből (Grace, Grade 62) készült és acetonitrillel kiegyensúlyozott oszlopra töltjük. Acetonitrillel mossuk az oszlopot. Az antibiotikumokat acetonitril és víz 4 : 1 arányú elegyével eluáljuk, az eluáció közben 25 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. A frakciókat a 3. példában megadott módon vizsgáljuk. A 21— 46. frakciók tartalmazzák az A—21978C keverék nagy részét, így ezeket egyesítjük, csökkentett nyomáson kis térfogatúra töményítjük és fagyasztva szárítjuk, amiután 605 mg tisztított, 900 egység/mg biológiai aktivitású A—21978C keveréket kapunk nátrium-sóként. 7. példa Az A—21978C keverék előállítása (savas alak) A 6. példában megadottak szerint előállított A— 21978C keverék nátrium-sójának 7 g-ját 150 ml vízben oldjuk, majd 150 ml n-butanolt adunk az oldathoz. Az oldat pH-ját 2N hidrogén-klorid oldattal 3,4-re állítjuk be, miközben egy órán át keverjük. Elkülönítjük az n-butanolos fázist és csökkentett nyomáson desztilláljuk. A desztillációs maradékot vízben oldjuk és fagyasztva szárítjuk, amiután 6 g savas alakban létező A—21978C keveréket kapunk. Az egyes A—21978C komponenseket a megfelelő savas alakká szintén a fentiek szerint alakítjuk át. 8. példa Az A—21978C keverék nátrium-sójának előállítása az A—21978C keverék savas alakjából A 7. példában megadottak szerint előállított savas .alakú A—21978C keverék 50 mg-ját meleg, vízmentes etanolban (5 ml) oldjuk. Cseppenként addig adunk IN nátrium-hidroxidot az oldathoz, míg pH-ja 9,4 lesz. A kapott oldatot egy éjszakán át szobahőmérsékleten tartjuk. A kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük és csökkentett nyomású térben szárítjuk, ami után 32 mg A—21978C keverék nátrium-sót kapunk. A só az atomabszorpciós vizsgálat szerint 8% nátriumot tartalmaz. 9. példa A 8. példában megadottak szerint eljárva, de a savas alakú A—21978C keverék etanolos oldatához etanolos kalcium-kloridot adva előállítjuk az A—21978C keverék kalcium-sóját. 10. példa Az A—21978 fermentlé és az elkülönítés során kapott minták mikrobiológiai értékmérése. Az A—21978 aktivitásának mennyiségi meghatározását fermentlevek és a feldolgozás során kapott minták esetén papírkorong agardiffúziós módszerrel határozzuk meg Micrococcus luteus mikroorganizmussal. A beoltott agardiffúziós lemezeket a megfelelő koncentrációjú mérőorganizmussal beoltott Nutrient agárral készítjük, oly módon, hogy 20 x 100 mm méretű műanyag Petri-csészébe 8 ml agart öntünk. A méréskor standardként A—21978C keveréket használunk. Ezt a készítményt 1000 egységnek vesszük. A nagymértékben tisztított A—21978C keverék 1250 egységet tartalmaz milligrammonként. A standard dózis-válaszgörbét 150—75—40—20—10 egység/ml-es oldatokkal készítjük el. A standard és a minták hígításához 0,1 mólos 6,0 pH-jú foszfát puffert használunk. A minták és a standard oldatait 12,7 mm átmérőjű papírkorongokra juttatjuk automatikus pipettával. Az inkubációt 30 C° hőmérsékleten 16—18 órán át végezzük. A gátlási zónákat módosított Fischer—Lilly Antibiotic Zone Reader mérőműszerrel határozzuk meg. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás az A—21978 antibiotikum keverék, illetve a C0, C], C2, C3, C4 és C5 komponensek és ezek sóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces roseosporus NRRL 11379 mikroorganizmust vagy ennek egy A—21978-at termelő mutánsát felhasználható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között tenyésztjük, majd kívánt esetben az A—21978 antibiotikum keveréket vagy ennek egy sóját elkülönítjük a fermentléből és kívánt esetben ebből önmagában ismert módon elválasztjuk az egyes komponenseket vagy ezek sóit. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az izolált A—21978 antibiotikum keverékből elkülönítjük az A—21978C antibiotikum keveréket vagy ennek egy sóját. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az izolált N—281978 C antibiotikum keverékből elkülönítjük az A—21978C0 komponenst vagy ennek egy sóját. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
