180723. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fáldalomcsillapító hatású pentapeptid-származékok előállítására
.33 180723 34-OH és DCC metilénkloridos oldatával kondenzálva állítottuk elő a Boc-(N-Me)-Met-szubsztituált gyantát. Ezután a peptid-gyanta vegyületre egymás után Boc-Phe-OH, Boc-GIy-OH, Boc-AIa-OH és Boc-Tyr-OH vegyüleleket kapcsoltunk először az alábbi 1. sz. program szerint, majd ugyanazokat az aminosavakat az alábbi 2. sz. program szerint. A 2. sz. programot minden aminosav esetén egyszer végeztük el, kivéve az L-Phe-OH-t, melyet háromszor ismételtünk. A keletkezett Boc-pentapeptid-gyanta vegyületröl az 1. sz. program 1—8. lépései szerint lehasítva a védőcsoportokat 6,13 g cím szerinti vegyületet kaptunk. Az 1. és 2. sz. program mosási műveleteit 1 g gyantára vonatkoztatva 10 ml oldószerrel végeztük. 1. sz. program 1. Háromszori mosás metilénkloriddal. 2. 5 perces kezelés trifluorecetsav-trietilszilán-metiléndiklorid 30 : 5 : 65 térfogatarányú elegyével. 3. A 2-es lépés ismétlése 30 percen át. 4. Kétszeri mosás metiléndíkloriddal. 5. Mosás metanol-metiléndiklorid 1 : 1 arányú elegygyel. 6. Kétszeri metanolos mosás. 7. Mosás metanol-etiléndiklorid 1 : 1 arányú elegygyel. 8. Mosás kétszer metiléndikloriddal. 9. Négyszeri, egyenként 2 percig tartó kezelés 4%-os metiléndikloridos DIEA oldattal. 10. A 4—8. lépések ismétlése. 11. Kezelés a kívánt aminosav-származék 2,5 mólnyi mennyiségének metilén-dikloridos oldatával és 1,25 mólnyi DCC metilén-dikloridos oldatával 120 percen át. 12. Négyszeri mosás metilén-dikloriddal. 13. Az 5—7. lépések ismétlése. 14. Háromszori mosás metiléndikloriddal. 2. sz. program 1. Négyszeri, egyenként 2 percig tartó kezelés 4%-os metiléndikloridos DIEA oldattal. 2. Kétszeri mosás metiléndikloriddal. 3. Mosás metanol-metiléndiklorid 1 : 1 arányú eiegygyel. 4. Kétszeri mosás metanollal. 5. Mosás metanol-metiléndiklorid 1 : 1 arányú elegygyel. 6. Kétszeri mosás metiléndikloriddal. 7. Háromszori mosás dimetil-formamid-metiléndiklorid 1 : 1 arányú eleggyel. 8. Kezelés a kívánt aminosav-származék 2,5 mólnyi mennyiségének dimetilformamid-metiléndiklorid 1 : 1 arányú elegyével készített oldatával és 1,25 mólnyi DCC metiléndikloridos oldatával 120 percen át. 9. Négyszeri mosás dimetil-formami.d-metiléndiklorid 1 : 1 arányú elegyével. 10. A 4—6. lépések ismétlése. B) L-tiroziI-D-alanil-gliciI-L-fenil-aIanil-Níl-metil-L-metionilamid hidrogénfluorid só Az A) pontban előállított peptid-gyanta vegyületet folyékony vízmentes hidrogénfluoridban vákuum alkalmazása mellett 60 percen át 0 C° hőmérsékleten anizollal reagáltatjuk. A reakcióelegyből az illékony komponenseket vákuumban eltávolítjuk és a peptid-gyanta vegyületet éterrel trituráljuk, majd szűréssel eltávolítjuk a maradék hidrogénfluoridot és anizolt. A peptidet a gyantából 10%-os ecetsavval történő triturálással extraháljuk, szűrjük, 3 x 50 ml 10%-os ecetsavval mossuk és liofilizálás után 940 mg nyers cím szerinti terméket kapunk. C) A végtermék kromatográfiás tisztítása. AB) pontban kapott 470 mg peptid-diasztereomer elegyet 3,8 v 58,5 cm méretű fordított fázisú (Clg) szilíkagéllel töltött oszlopon alacsony nyomáson (7,17 kg/cm2) 25% acetonitrilt tartalmazó, 0,1 n ammóniumacetát oldattal kromatografáljuk. 1 perces frakciókat szedünk és a 98—150 frakciókat egyesítjük, majd liofilizálás után 360 mg terméket kapunk. A B) pontban kapott nyers elegy maradékát a fentiek szerint kromatografálva további 320 mg terméket kapunk. A fenti kapott liofilizált termékeket egyesítjük és 2,5 x 10,0 cm méretű Sephades G—10 oszlopon kromatografáljuk 0,2 n ecetsav alkalmazásával a maradék ammóniumacetát eltávolítására. A terméket tartalmazó frakciókat liofilizálva 636,7 mg cím szerinti terméket kapunk. Md“ + 19,7c (c=0,5, 1 n sósav). [a]|g5a + 71,70° (c=0,5, 1 n sósav). Analízis a C3|H43N6OgS képlet alapján: számított: C 56,35%; H 6,71%; N 12,72%; S 4,85%. mért: C 56,60%; H 6,43%; N 12,97%; S 4,92%. Az aminosav-analízis talált értékei: alanin 0,99, tirozin 1,01, glicin 1,00, fenilalanin 1,01, NH3 1,10, peptid .9,31%: illetve alanin 1,00, tirozin 1,01, glicin 1,00, fenilalanin 0,97, NH3 1,02, peptid 90,5%. Az I általános képletű vegyületeket fájdalomcsillapítókként hasznosíthatjuk. Egéren a „hot plate”-(forrólap-)módszerrel mutattuk ki az I általános képletű vegyületek fájdalomcsillapító hatását. E módszer szerint egy függőlegesen álló plexihenger aljára tesszük a kísérleti egeret, amely hengert alul egy 52 C° hőmérsékleten tartott forró lap zár le. Az egérnek a vizsgálandó anyag valamely alkalmas vivőanyaggal készült oldatából vagy szuszpenziójából előre meghatározott mennyiséget adunk be szubkután (bőr alá adott) injekció formájában. A vizsgálandó anyag beadása után meghatározott ideig várunk, majd az egeret rátesszük a forró lapra és feljegyezzük, hogy a vizsgált anyag beadásának hatására a kontrolihoz képest mennyivel később következik be az alábbi két, egymástól független jelenség: először mérjük, hogy hány másodperc múlva nyalja meg az egér a hátsó talpát, másodszor pedig azt mérjük, hány másodperc múlva próbál az egér kiugrani a hengerből. Fájdalomcsillapító szerek hatására e két jelenség lényegesen késleltetve következik be, a csak vivőanyagot tartalmazó injekcióval kezelt kontrollcsoport állatainak hasonló értékeihez képest. E késleltetésnek olyan dózisszinteknél kell bekövetkeznie, amelyek hatására az állatok mozgása még nem lesz rendezetlen, ill. mozgásképességük nem csökken. A következő táblázatban a találmány szerinti vegyületeknek a fenti módszerrel mért hatását mutatjuk be, egyrészt a kontrollcsoporttal, másrészt természetes enkefalinnal, ill. az amidjává alakított természetes enkefalinnal összehasonlítva. Az I. táblázat tartalmazza a hátsó talp megnyalás késleltetésére vonatkozó adatokat, a 11. táblázat a menekülő ugrás késlel-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 17
