180431. lajstromszámú szabadalom • Diagnosztikum proteolitikus enzimek kimutatására
3 180431 4 következménye. Még súlyosabbnak tűnik az a tény, hogy ezen vizsgálati eljárásnak várhatóan hiányos a szelektivitása az eritrocitákkal szemben. Néhány év óta általánosan elterjedtek a hiszto- és citokémiai kimutatási módszerek, amelyek a meghatározandó rendszerben levő enzimek észterolízises aktivitásán alapulnak (lásd például Pearse, A. G. E., Theoretical and Applied Histochemistry 3. kiadás 1968. Churchill Livingstone, Edinburgh— London—New York). Ennek az eljárásnak az az alapelve, hogy színtelen vagy halvány színű észtert alkalmaznak, melyek azután enzimes bontással színtelen sav és ugyancsak színtelen alkohol (fenol) alkotórészekre bomlanak. Ez utóbbit enzimes elszappanosítási követően termékké alakítják (például diazoniumsókkal vagy oxidativ reakcióval). Schmalzl, F. és Braunsteiner, H. például a Kiin. Wschr. 46, 642 (1968)-ban specifikus citokémiai leukocita-eszterázkimutatást ismertetnek, amelyben szubsztrátu inként naftol-AS-D-klór-acetátot alkalmaznak és a színes azovegyület képzéséhez diazoniumsót. A leukociták gyors és egyszerű kimutatására a testnedvekben, mint például a vizeletben, ilyen két komponensű rendszerek nem alkalmasak diagnosztikumként, mivel a vizeletben levő számos más vegyidet — így például urobilinogen, szterkobilinogén, bilirubin stb. — is reagál a diazoniumsókkal. Ezenkívül ez a kimutatás nem elég érzékeny. Például olyan minták, amelyekben 5000 leukocita/gl van, nem jeleznek reakciót. Az 1 128 371 számú brit szabadalmi leírásban a testnedvekben levő hidrolitikus enzimek kimutatására alkalmas diagnosztikumot ismertetnek. Ebben egy szívóképes hordozót itattak át színtelen indoxil- vagy tioindoxilészterrel, adott esetben pufferral és oxidálószerrel. Hidrolitikus enzim jelenlétében az észterből szabad indoxil vagy tioindoxil keletkezik, és a levegő oxigénjének vagy oxidálószer hatására erős színű indigó vagy tioindigó keletkezik. Az ebben a szabadalmi leírásban ismertetett vegyületek nem alkalmasak a leukociták meghatározására, mivel 10 000 leukocita/gl esetén sem mutatkozik reakció. így napjainkig sincsen a kereskedelmi forgalomban olyan tesztcsík, amely lehetővé teszi a leukociták egyszerű és gyors kimutatását a vizeletben, annak ellenére, hogy a leukociták kimutatása a vizeletben az egyik leggyakrabban végzett klinikai vizsgálatok közé tartozik. Meglepő módon azt találtuk, hogy stabil és gyorsan jelző diagnosztikumot — amelynek segítségével a testnedvekben a leukocitákat jól ki lehet mutatni — kapunk, ha szubsztrátumként a neutrofil leukocitákban, granulocitákban lévő észterázok (proteázok) kimutatására indoxil- vagy tioindoxil-aminosavésztereket vagy -peptidésztereket alkalmazunk. A kísérletek azt igazolták, hogy ezek a szubsztrátumok a proteolitikus enzimek, így például elasztáz, kimotripszin vagy tripszin tiszta vizes oldatában, vagy testnedvekben, mint például a plazmában, szérumban, liquorban, hasnyálmirigy-váladékban, vagy a széklet vizes kivonatában való általános kimutatására is kiválóan alkalmasak. A találmány tárgya diagnosztikum a proteolitikus enzimek, elsősorban a testnedvekben lévő leukoeiták proteázainak kimutatására, ami szívóképes hordozóból, filmrétegből, porkeverékből, liofilizátumból, oldatból vagy reagenstablettából áll, amely egy vagy több kromogént és a szokásos adalékanyagokat tartalmazza, a találmány szerinti diagnosztikumot az jellemzi, hogy kromogénként valamely I általános képletű indoxil- és/vagy tioindoxil-aminosav-észtert és/vagy -peptidésztert — amelyben Ru R2, RS, R, jelentése lehet azonos vagy eltérő, hidrogén- vagy halogénatom, 1—4 szénatomszámú alkil, vagy 1—4 szénatomszámú alkoxicsoport. X jelentése kénatom, vagy adott esetben 1—4 szénatomszámú rövidszénláncú alkilcsoporttal, fenil- vagy naftilesoporttal vagy fenil- vagy naftil- (1—4 szénatomszámú)—alkilcsoporttal vagy benzoilcsoporttal szubsztituált aminocsoport, A jelentése alifás, aromás, nem heterociklusos, természetes L-monoamino-karbonsavak valamelyike, vagy ezek D- vagy DL-alakja vagy 2—5 tagú, fenti aminosavakból álló peptidcsoport, B jelentése a peptidkémiában szokásos nitrogénvédőcsoport —tartalmaz. A találmány további tárgya eljárás az I általános képletű indoxil- és/vagy tioindoxil-aminosavésztereket és/vagy -peptid-észtereket tartalmazó diagnosztikumok előállítására, amelyek segítségével proteolitikus enzimeket, elsősorban a testnedvekben lévő leukociták proteázait lehet kimutatni. Valamennyi I általános képletű indoxil- és tioindoxil-aminosav-észter és -peptid-észter új vegyület. A találmány tárgya továbbá az I általános képletű indoxil- és tioindoxil-aminosav-észterek és -peptid-észterek előállítási eljárása is. Az I általános képletű új indoxil- és tioindoxil-aminosav-észtereket és -peptid-észtereket a peptidkémiában ismert módszerekkel állíthatjuk elő. Előnyös — ismert módon ■— valamely megfelelő II általános képletű indoxil- vagy tioindoxilszármazékot — ahol az R1; R2, R3, R, és X jelentése a fenti — egy III általános képletű aminosavval és pepiiddel — ahol az A és B jelentése a fenti —, illetve ezek egy reakcióképes származékával reagáltatunk. Reakciószármazékként például savkloridokat, illetőleg a peptidszintézisben szokásosan használt vegyes anhidrideket, például klórhangyasav-etil-észtert vagy aktív észtert alkalmazhatunk. A II általános képletű indoxil- és tioindoxilszármazékok, valamint a III általános képletű aminosavak és peptidek ismert anyagok [lásd például Friedlaender, P. Fortschritte der Teerfarbenfabrikation und verwandter Industriezweige, 3— 20. kötet, illetőleg Houben—-Weyl, Methoden der organischen Chemie, 15/lk.], vagy ismert vegyületek analógiájára előállíthatok. Az Ru Ra, R3, R4 azubsztituens definíciójában a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
