180030. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bakteriosztatikus hatású anyag előállítására
5 180030 6 néha szabad szemmel is láthatók. A mikroszkopikus vizsgálat feltár olyan zónákat, melyekben a Beggiatoa szálak szennyeződésmentesnek látszanak. Steril szikével kivágjuk az egyik ilyen zónát, és az előzővel azonos összetételű friss táptalajra helyezzük, miközben ügyelünk arra, hogy a Beggiatoa szálakat tartalmazó felület az új csészében is tiszta felületre kerüljön. Ezután ismét 24 órás, 30 °C-os inkubálás következik. A kivágás, a másodlagos baktériumtenyésztés és az inkubálás műveleteket még kétszer megismételjük. Végül tiszta Beggiatoa tenyészetet nyerünk. 2. példa (a törzsek tartósítása) Tíz törzset különítünk el az 1. példában ismertetett módon. A törzsek a szálak átmérőiben, a csúszási sebességükben és az agar-agar táptalajain levő telepeik alakjaiban térnek el egymástól. Attól függően, hogy rövid-, közép- vagy hosszútávú tartósítást szeretnénk elérni, három különböző módszer alkalmazható. 2.1. Rövidtávú tartósítás: a gondosan lezárt petricsészét 4 CC-os hűtőszekrényben tartjuk. Mivel az agaragar hajlamos a kiszáradásra, a törzseket legalább 10 naponként át kell helyezni. 2.2. Középtávú tartósítás: elkészítünk egy alábbi öszszetételű fél-folyadék halmazállapotú táptalajt: élesztőkivonat 2 g kalcium-klorid 0,1 g nátrium-acetát 0,5 g agar-agar 2 g szűrt termálvíz 1000 ml A táptalajhoz a sterilizálást követően hozzáadunk milliliterenként 10 nemzetközi egység (IU) gombakatalázt. A katalázoldatot előzőleg 0,22 mikrométer átmérőjű mikroszkopikus pórusokkal rendelkező Millipore szűrőn történő hideg szűréssel sterilizáljuk. A Beggiatoát tartalmazó kis kockányi agar-agart 10 ml táptalajt tartalmazó tubusba helyezzük, és 33 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A Beggiatoa a tubus felső részén indul fejlődésnek. A csövet 3 héten keresztül tartjuk 30 "C-on. Ezután a tenyészetet 0,1 ml-es részletekben tubusokba helyezzük. 2.3. Hosszútávú tartósítás: a 3. példában leírt módon kevert táptalajban egy 24-órás tenyészetet állítunk elő. Centrifugálás után a kivált részt steril Ringer-oldattal mossuk, majd megfagyasztjuk és fagyasztással szárítjuk. Szorosan záró konténerben több hónapig tároljuk hűtőszekrényben. Újrahidratáláskor a szálak fragmensei fejlődőképesek. 3. példa (a törzsek tenyésztése) 3.1. Oltóanyag Az 1. példában leírt módon kikészített mintából kivágunk egy kis kockányi (5 mm3) agar-agart, melyet egy 500 ml-es edénybe helyezzük, melyben 100 ml alábbi összetételű táptalaj van: élesztőkivonat 4 g kíTcium-klorid 0,2 g ammónium-acetát 1 g szűrt termálvíz 1000 ml A közeg pH-értéke 6,6. Az edényt 150 l/perc fordulatszámú 1,25 cm-es iherciasugarú forgó keverőbe helyezzük, és 16 órán keresztül keverjük 30 °C-on. A kapott tenyészetet steril körülmények között Sorvall Omnimixerben 15—30 percig homogenizáljuk. Á homogenizált tenyészet alkotja az oltóanyagot. 3.2. Tenyésztés A fenti oltóanyag 5 ml-ét egy 500 ml-es edénybe helyezzük, amely az oltóanyag előállításához használt táptalajból 100 ml-t tartalmaz. Az edényt 24 óráig inkubáljuk forró keverőben 30 °C-on. A tenyészet egy liternyi mennyiségéből 0,8 g száraz Beggiatoát nyerünk. Az eljárást több törzzsel megismételjük, miközben a körülményeket az említett határok között változtatjuk, és így a tenyészet egy liternyi mennyiségéből 12,5 g és 2 g közötti súlyú száraz Beggiatoát termelünk ki. 3.3. A növekedés mérése A pehelyszerű növekedése miatt a Beggiatoa esetében a hagyományos zavarosságvizsgálati eljárás közvetlenül nem alkalmazható, hanem azt adaptálni kell az adott esethez. Sorvall Omnimixerrel homogenizált tenyészetből két óránként mintákat veszünk. A minták optikai sűrűségét spektrofotométerrel határoztuk meg 600 nmen. A homogenizált minta lassú leülepedése megbízható eredmények leolvasását teszi lehetővé. Az így kapott növekedési adat közvetlen kapcsolatban van a sejtek számával. 3.4. A száraz súly meghatározása A Beggiatoa szokásos kemencében történő szárítása nem szolgáltat reprodukálható eredményeket. Ez valószínűleg a nagyon magas víztartalma miatt van. Ezért a reprodukálható eredmények érdekében fagyasztásos eljárással sohasem szárítunk 400 ml-nél kisebb menynyiségű tenyészetet. 3.5. A bakteriosztatikus aktivitás meghatározása A bakteriosztatikus aktivitás kiértékelésének a Public Health Laboratory Service Committee által kifejlesztett és ismertetett [British Medical Journal, 408 (1965)] hagyományos eljárása a Beggiatoa esetében nem vezet kielégítő eredményekhez, mert a vizsgálatot tubusokban végzik el. Minthogy a Beggiatoa szigorúan aerob körülményeket igényel, a vizsgálati tubusban levő oxigénkoncentráció nem kielégítő. Ennek megfelelően a módszert tökéletesíteni kell, és az oxigén átáramoltatása érdekében kevert edényeket kell alkalmazni. Elkészítettünk egy olyan sorozatot, ahol 50 ml-es edényekbe 18—18 ml baktérium-táptalajt (Nutrient Broth Difco) helyeztünk. Az első és a második sorozat edényeit kórokozó törzsek 24 órás tenyészeteinek 0,4 mles mennyiségeivel oltottuk be. Három kórokozó törzset használtunk, nevezetesen a Pseudomonas aeruginosa ATCC 10 145, az Escherichia coli ATCC 11 755 és a Staphyllococcus aureus ATCC 12 600 törzseket. Bakteriosztatikus minták előállítását a 3.2. példában ismertetett módon végeztük el azzal a különbséggel, hogy a tenyészetet csak 8 órán keresztül centrifugáltuk. A centrifugált biomasszát homogenizáltuk, majd a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
