180030. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bakteriosztatikus hatású anyag előállítására
3 180030 4 munkaigényesnek és nehézkesnek bizonyultak, és az elkülönített mikroorganizmusok tenyésztése — többek között törékenységük és magas víztartalmuk miatt — csak nagyon gyenge hozamokat eredményezett. Jellemzőnek tekinthető egy közzétett kitermelési érték, miszerint 1 liter 2 g élesztőkivonatot, 0,1 g nátrium-acetátot és aktív katalázt tartalmazó 28 °C-os, keverés nélküli táptalajból 48 óra alatt 1,2 g mikroorganizmust nyertek ki. Jelen találmány egyik célja, hogy lehetővé tegye a bareginhez hasonló bakteriosztatikus hatású anyag gazdaságos, ipari méretekben történő előállítását. A bakteriosztatikus anyagot a találmány szerinti eljárással úgy állítjuk elő, hogy vizes táptalajban, keverés és aerob körülmények biztosítása mellett az NCIB 114 18—114 25 szám alatt letétbe helyezett, Beggiatoa típusú mikroorganizmus törzsek legalább egyikét 5—36 órán keresztül, 20 °C és 50 °C közötti hőmérséklettartományban, 6 és 8 közötti pH-értcken tenyésztjük, mikoris a vizes táptalaj mikroorganizmussal való beoltása előtt az oltóanyagot kívánt esetben homogenizáljuk, majd a biomasszát és/vagy a táptalajt összegyűjtjük és kívánt esetben a biomasszát kifagyasztással szárítjuk. A találmány szerinti eljárásra az jellemző, hogy Beggiatoa típusú mikroorganizmusokat tenyésztünk vizes táptalajban keverés és aerob körülmények biztosítása mellett, és a biomasszát és/vagy a táptalajt összegyűjtjük. Megállapítást nyert, hogy a Beggiatoa típusú mikroorganizmusok biomasszája, de még az azt tartalmazó közeg is bakteriosztatikus hatással rendelkezik. Azt is megállapítottuk, hogy a mikroorganizmusok törékenysége nem jelent akadályt az erősen kevert közegben történő intenzív tenyésztés számára, minthogy a mikroorganizmusok még akkor is szaporodnak, ha szálaik számos fragmenssé töredeznek szét. így, a Beggiatoa típusú mikroorganizmusokból álló oltóanyag táptalajba történő beoltása előtti homogenizálása még előnyös is lehet. A leírásban ezentúl szándékosan inkább a „Beggiatoa típusú mikroorganizmus” kifejezést használjuk a „Beggiatoa törzsbe tartozó mikroorganizmus” helyett. A Beggiatoa törzs a „csúszó baktériumok” osztályába, a nyálkabaktériumok rendjébe és a Beggiatoaceae családba tartozik. [Lásd Bergey’s Mannal of Determinative Bacteriology, 8. kiadás, Waverly Press, Baltimore, USA (1974), 112—114. old.] Mint az említett, szakmabeli tekintélynek örvendő munkából is látható, megbízható információk hiánya miatt ennek a mikroorganizmus törzsnek az osztályozása meglehetősen bizonytalan. A kérdéses mikroorganizmusok osztályozásának ezen bizonytalansága tükrében helytelen lenne olyan precíz szakkifejezés, mint a „törzs” használata. Ezért, jelen találmány szövegösszefüggéseiben a „Beggiatoa típusú mikroorganizmus” kifejezés alatt a kéntartalmú talajokra és vizekre jellemző szálszerű baktériumokat értjük, melyekre az jellemző, hogy a színtelen szálak — az osztályozás Beggiatoa törzsbe tartozó baktériumaihoz hasonlóan — csúszva mozognak és sejtek láncolataiból épülnek fel. A Beggiatoa típusú mikroorganizmus előnyösen bareginből történő elkülönítéssel nyerhető ki. Megállapítást nyert, hogy egy bizonyos eljárás alkalmazásával lehetséges az említett elkülönítés és, hogy ezzel az eljárással kinyert törzsek tenyészthetők és bakteriosztatikus hatással rendelkeznek. Megállapítottuk végül, hogy a törzsek megőrzésének problémája is kielégítő módon megoldható. Egy törzs elkülönítése céljából egy baregin-mintát agar-agart tartalmazó táptalajra helyezünk, és 5—36 órán keresztül inkubáljuk 25—50 °C-os hőmérséklettartományban. Ezután a Beggiatoa típusú mikroorganizmus-szálak egy szennyeződésmentes területét kivágjuk, és ismét ráhelyezzük egy az elsővel azonos összetételű, — agar-agart tartalmazó táptalajra. Az inkubálás, a kivágás és a másodlagos baktériumtenyésztés műveletei kétszer vagy háromszor megismételhetők. Ezt az eljárást alkalmaztuk annak a 8 törzsnek az elkülönítésére, melyeket az NC113 114 18-tól 114 25-ig terjedő sorszámok alatt 1978. július 12-én helyeztünk letétbe a skóciai Aberdeenben levő National Collection of Industrial Bacteria (NCIB)-ben. Ennek megfelelően, a találmány szerinti eljárás ezen 8 törzs legalább egyikének a felhasználásával hajtható végre. Az elkülönítésnél alkalmazott agar-agart tartalmazó táptalaj 1 liter vízre számítva 10—20 g agar-agart tartalmaz. Hasonlóképp, a mikroorganizmusok tenyésztésénél alkalmazott vizes táptalaj 1 liter vízre számítva előnyösen 1—4 g élesztőkivonatot, 0,1—0,3 g kalcium-kloridot és 0,2—1 g nátrium- vagy ammónium-acetátot tartalmaz. Előnyösen kéntartalmú termálvizet használunk. A tenyészet megóvása érdekében a táptalajhoz katalázt is hozzáadhatunk, például milliliterenként 5—20 nemzetközi egység (international unit, IU) mennyiségben. A mikroorganizmust 5—36 órán keresztül tenyészthetjük 20 °C és 50 °C közötti hőmérséklettartományban, 6 pH és 8 pH-értékek között. Előnyös a tenyésztést 8—10 órán keresztül, 30—40 °C-on és semleges pH-értéken végezni. A találmány szerinti eljárással nyert bakteriosztatikus hatású anyag bőrmasszázsnál használható fel, vagy pedig bőrkozmetikai készítmények alkotórészeként. A biomassza szárított formában tartósítható. A mikroorganizmusok törékenysége és alacsony száraz anyagtartalma miatt a szárítást előnyösen kifagyasztással végezzük. A következő, bemutatás célját szolgáló példák lehetővé teszik, hogy jobban megértsük a találmány lényegét. A példákban a „Beggiatoa típusú mikroorganizmus” kifejezés helyett rendszeresen a vele azonosnak értendő „Beggiatoa” elnevezést használjuk. 1. példa (a törzsek elkülönítése) Thermes Nationaux d’Aix-les-Bains-ből származó friss baregin-pelyhet egy petricsésze közepébe helyezünk el, melyben 20 ml agar-agart tartalmazó, alábbi összetételű táptalaj van : élesztőkivonat (Difco) 2 g agar-agar (Bacto—Difico) 15 g Aix-ből származó szűrt termálvíz 100 ml desztillált víz 900 ml A csészét felfordítva 30 órán át egy 30 °C-os kemencében tartjuk. Ezután a Beggiatoát jellemző spirál alakú képződmények — melyek a mikroorganizmusok csúszó mozgásának eredményeképp keletkeznek — jelenlétének kimutatása céljából mikroszkopikus (kis nagyítású) vizsgálatot h'jtunk végre. A képződmények 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
