180002. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az ösztradiol új 4-[p-[bisz(2-klór-etil)-amino]fenil]-vajsav-származékainak előállítására
11 180002 12 mék képződik. Desztillált vízzel eltávolítjuk a piridint és az ecetsavat, majd a terméket vízzel semlegesre mossuk. A vízfázist elkülönítjük, az olajfázist szárító kamrában, vákuumban szárítjuk, így 40 mg olajos terméket kapunk. A terméket szilikagélen karomatografáljuk etil-acetát és ciklohexán 10: 50 térfogatarányú elegyével; az így kapott tisztított termék viszkózus olajos vegyület. Az IR spektrumban 3600—3200 cm-1 között nem találtunk abszorpciót. Az elemzés igazolja, hogy a termék 3-propioniloxi-l,3,5(10)-ösztratrién-17f}-ol-{{4-{p-[bisz(2-klór-etil)-amino]-fenil}-butiril-oxi}}-acetát. 8. példa 3-benzoiloxi-l ,3,5(10)-ösztratrién-17 ß-ol-{{4-{p-[bisz(2-klór-etil)-a mino]-fenil }-butiril-oxi }}-acetát előállítása 1 ml vízmentes piridinben feloldunk 50 mg 3,17 ß-dihidroxi-1,3,5(10)-ösztratrién-17 (3-{{4-{p-[bisz(2-klór-etil)-amino]-fenil}-butiril-oxi}}-acetátot, hozzáadunk 2 g benzoesavanhidridet és az elegyet egy napon át hűtőszekrényben tartjuk. A reakcióterméket 30 °C hőmérsékleten vízfürdőn, vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot összekeverjük desztillált vízzel és az elegyet 1,5 órán át állni hagyjuk, így kolloid olajos termék képződik. Desztillált vízzel eltávolítjuk a piridint és az ecetsavat, majd a terméket vízzel semlegesre mossuk. A vízfázist elkülönítjük és az olajos fázist szárító kamrában, vákuumban szárazra pároljuk, így 45 mg olajos terméket kapunk. A terméket szilikagélen kromatografáljuk etil-acetát és ciklohexán 10: 50 térfogatarányú elegyével, az így kapott tisztított termék viszkózus olajos vegyület. Az IR spektrumban 3600—3200 cm_) között nem találtunk abszorpciót. Az elemzés igazolja, hogy a termék 3-bcnzoiloxi-l,3,5(10)-ösztratrién-17S-ol-{{4-{p-[bisz(2-klór-etil)-amino]-fenil}-butiril-oxi}}-acetát. A találmány szerint előállított vegyületek gyógyászati hatékonyságát az alább leírt tesztekkel vizsgáltuk. 1. teszt A találmány szerint előállított klórambucil-származékok akut toxicitása és daganatellenes hatékonysága (in vivo): (1) Akut toxicitás (LD50) vizsgálat A félhalálos dózis meghatározásához egy csoportban nyolc darab öthetes ICR—JCL nőstény egeret tenyésztettünk átlátszó műanyag ketrecekben. A hatóanyagokat (1. táblázat 1., 2., 3. és 4. sz. minták) olívaolajban oldottuk és az egyes egereknek minden adagot vagy intraperitoneális (ip) vagy szubkután (se) injekcióként vagy szájon át (po) adtuk be. Hét nap eltelte után Litchfield ^ Wilcoxon-gráf-módszerrel meghatároztuk a félhalálos dózis értékeket. Az ismert klórambucil-gyógyszer beadásakor az LD50 szám ip beadás esetén 20 mg/kg, po beadás esetén 80 mg/kg és se beadás esetén 26 mg/kg. 5 A találmány szerint előállított klórambucil-származékok közül a 2. sz. mintánál a megfelelő értékek nagyobbak voltak mint 2000 mg/kg ip, illetve se beadás esetén, és nagyobb mint 6000 mg/kg po beadás esetén. A po, illetve se beadásnál kapott teljes eredményt mutatja az 10 1. táblázat. 1. táblázat ld50 15 A minta száma í 2 3 4 LD50 (mg/kg) 20 (orális beadás) 80 6000< 3000-c 3000 < LD50 (mg/kg) (szubkután beadás) 26 2000< 2000< 2000< 25 (2) Daganatellenes hatás vizsgálata (in vivo) \ vizsgálati alanyok öthetes BALB(C-nu)nu egerek. Emberi emlőből vett rákos sejtszöveteket ültettünk az egerek hónaljában levő bőr alá, ahol szilárd daganato- 30 kát alkottak. A beültetés után 24 órával először, majd másodpercenként, összesen 10 alkalommal a hatóanyag ollvaolajos diszpergátumát vagy oldatát adtuk be szubkután injekcióként vagy szájon át. A beültetés utáni 25. napon kimetszettük a daganatokat. A daganat- 35 ellenes hatékonyság meghatározására 10 darab — hatóanyaggal kezelt — egérnél vettük a kimetszett daganatok át’agsúlyát (A) és 10 kontroll egérnél a kimetszett dagan; tok átlagsúlyát (B). A 40 D \ganatinhibíció hatékonysága (%)=(1------)X100. B Mindkét — szájon át, illetve szubkután — beadás esetén 15 mg/kg adagnál az ismert klórambucil-gyógyszer daganatellenes hatása 50—70% közötti volt, míg a 45 találmány szerint előállított klórambucil-származékoknál a hatékonyság meghaladta a 90%-ot, ugyanakkor a találmány szerinti hatóanyaggal kezelt egerek mind életben maradtak. A boncolás után megállapítottuk, hogy az ismert 50 klórambucil-gyógyszer beadása után komoly elváltozások keletkeztek a lépben, a méhben és a csecsemőmirigyben, míg a találmány szerinti hatóanyagok beadása után ilyen elváltozásokat nem figyeltünk meg. A 2. táblázat ezeket a vizsgálati eredményeket szen - 55 léiteti. 2. tábláza* Daganatellenes hatékonyság A minta száma 1 2 3 4 5 Orális beadás Adag (mg/kg) Túlélési arány Inhibíció hatásfoka (%) 10 8/10 55 15 7/10 70 10 10/10 92 15 10/10 98 10 10/10 91 15 10/10 93 10 10/10 93 15 10/10 97 15 10/10 0 6
