179990. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polopeptidek előállítására
5 179990 6 Nősténypatkányokat 3,4 és 5 napos korukban 100 p.g tesztoszteron-propionáttal kezelünk, az ily módon androgén sterilizált nőstény patkányok állandó ösztrus vaginális kenettel és a petefészkekben számos preovulációs tüszővel rendelkeznek. A luliberin és aktív analógjai beadásakor LH és FSH szabadul fel, mely a Fallopian tubulusokban pete és a petefészkekben friss sárgatest megjelenésével mérhető. A példákban leírt valamennyi (I) általános képletű vegyület állandó ösztrusú patkányokban erősebben idéz elő ovulációt mint a luliberin és a legkisebb hatásos dózis legalább négyszeresének megfelelő mennyiségben beadva nem okoz toxikus tüneteket. Különösen kedvező tulajdonságokkal rendelkeznek a 4., 6. és 7. példában leírt vegyületek, melyek a luliberinnél mintegy százszor hatásosabbak és a legkisebb hatásos dózis százszorosának megfelelő mennyiségben sem okoznak toxikus hatásokat. Találmányunk tárgya továbbá eljárás hatóanyagként valamely (I) általános képletű vegyületet vagy humánvagy állatgyógyászati szempontból alkalmas sóját és a humán- vagy állatgyógyászatban használatos hígítóvagy hordozóanyagot tartalmazó humán- vagy állatgyógyászati készítmények előállítására. A találmányunk szerinti eljárással előállítható gyógyászati készítményeket orális vagy bukkális adagolásra alkalmas formában formulázhatjuk pl. tabletta, kapszula, oldat vagy szuszpenzió alakjában; orron keresztül történő adagolásra alkalmas formában pl. beszippantó készítmény, orrspray vagy orrcseppek alakjában; vaginális vagy rektális adagolásra alkalmas formában pl. kúp alakjában; vagy parenterális adagolásra alkalmas formában, pl. steril injiciálható oldat vagy szuszpenzió alakjában. A fenti gyógyászati készítményeket ismert módszerekkel szokásos excipiensek felhasználásával állíthatjuk elő. Az orális adagolásra kerülő készítményeket a polipeptid hatóanyagnak a gyomorban levő enzimektől való megvédése céljából előnyösen bevonattal láthatjuk el. A találmányunk szerinti eljárással előállítható gyógyászati készítmények az (I) általános képletű polipeptiden kívül egy vagy több ismert, az (I) általános képletű hatóanyaggal szinergiste kölcsönhatásba nem lépő gyógyszert pl. valamely prosztaglandin-származékot, mint pl. PGF2a-t, cloprostenolt vagy fluprostenolt, vagy más gyógyszert pl. clomiphent vagy tamoxifent is tartalmazhatnak, ezek azonban nem képezik a találmány tárgyát. A hatóanyagokat előnyösen orális adagolásra alkalmas alakban pl. mintegy 2,5—500 mg, különösen 10— 100 mg (I) általános képletű polipeptidet tartalmazó tabletták, kapszulák, drazsék vagy boluszok formájában, vagy parenterális adagolásra alkalmas formában pl. milliliterenként 5 ;xg—1 mg, előnyösen 10—100 ;zg (I) általános képletű polipeptidet tartalmazó oldatok alakjában készíthetjük ki. A parenterális adagolásra alkalmas készítmények előnyösen szükség esetén pH=5—9 értékre pufferezett izotóniás só-oldatok vagy izotóniás dextróz-oldatok lehetnek. Előállíthatunk további lassú hatóanyag-leadást biztosító parenterális készítményeket is, melyek adagolási egységenként általában több (I) általános képletű hatóanyagot tartalmaznak mint a szokásos injekciós készítmények. A lassú hatóanyag-leadásra szolgáló parenterális készítmények adagolási egységenként előnyösen 100 [i.g—1,0 mg (I) általános képletű hatóanyagot tartalmaznak. Az (I) általános képletű hatóanyagok napi dózisa orális adagolás esetén általában 50 p.g és 20 mg/kg közötti érték; parenterális adagolás — pl. intravénás, szubkutáns vagy intramuszkulárís injekció vagy infúzió — esetében általában kb. 0,2 ug/kg és 100 p.g/kg közötti érték. Humángyógyászatban e dózisok 3,5 mg—1,4 g orális, illetve 14 u.g—7 mg parenterális napi dózisnak felelnek meg. A nyálkamembránokon keresztül történő adagolás esetén az orális és parenterális érték közötti dózistartományt alkalmazhatjuk. Eljárásunk további részleteit a példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a. példákra korlátoznánk. A példákban megadott Rf értékek szilikagél lemezen (kieselgel G) leszálló vékonyrétegkromatográfiás (vrk.) meghatározással mért adatok. A kromatográfiás meghatározásoknál az alábbi oldószer-elegyeket alkalmazzuk: bután-1-ol/ecetsav/víz (4:1:5 tf.-rész); (RfA); bután-l-ol/ecetsav/víz/piridin (15:3:12:10 tf.-rész), (RfB); bután-2-ol/3 súly/tf.%-os vizes ammóniumhidroxid (3 : 1 tf.-rész, RfC); acetonitril/víz 3 : 1 tf.-rész (R/D); aceton-kloroform (1: 1 tf.-rész), (RfE); kloroform/etanol (1: 4 tf.-rész), (RfF); ciklohexán/etilacetát (1:1 tf.-rész), (RfG); ciklohexán-etilacetát/metanol (1:1:1 tf.-rész), (RfH); kloroform/metanol/víz (11:8:2 tf.r-rész), (RfK); kloroform/metanol (19 : 1 tf.-rész), (RfP); kloroform/metanol (9: 1 tf.-rész), (RfQ). Minden esetben a lemezeket UV fénnyel vizsgáljuk és fluoreszcaminnal, ninhidriddel és klór-keményítő-jódreagenssel kezeljük. Az Rf értékek a fenti módszerekkel előhívott egyetlen foltra vonatkoznak feltéve, hogy mást nem közlünk. A termékek savas hidrolizátumait oly módon készítjük el, hogy a peptidet vagy védett pepiidet lezárt evakuált csőben 1 súly/tf% fenolt tartalmazó 6 n sósavban 16 órán át 100 C°-on melegítjük. A hidrolizátumok aminosav-összetételét LoCarte aminosav-analizátorral határozzuk meg; a kapott eredmények minden esetben összhangban voltak a várt összetétellel. A leírásban használt „szokásos módon feldolgozzuk” kifejezés azt jelenti, hogy a reakció után a szilárd maradékot szűréssel eltávolítjuk, a szűrletet 40 C°-nál alacsonyabb hőmérsékleten szárazra pároljuk, az etilacetátos maradékot 20%-os citromsav-oldattal, vízzel, telített nátriumhidrogénkarbonát-oldattal és vízzel mossuk, vízmentes nátriumszulfát felett szárítjuk és az etilacetátot vákuumban ledesztilláljuk. A kívánt vegyület marad vissza. 1—10. példa L-piroglutamil-L-hisztidil-L-triptofil-L-szeril-L-tirozil-A-L-leucil-L-arginil-L-prolil-E-F szintézise : (m) általános eljárás (1. és 2. séma) 0,2 millimól L-piroglutamil-L-hisztidin-hidrazid, 0,9 ml dimetilformamid és 0,7 ml dimetilszulfoxid 0 C"-ra hűtött szuszpenziójához keverés közben 0,9 millimól 5,7 n dioxános sósavat adunk. 5 perces erőteljes keverés után átlátszó oldatot kapunk. Az oldatot —20 C°-ra hűtjük, 0,22 millimól tercier butilnitritet adunk hozzá és a keverést 25 percen át folytatjuk. A reakció-elegyet 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
