179965. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glukagonnak gél-szűréssel történő tisztítására
3 179965 4 títására vonatkozó korábbi eljárásoknál jelentkeznek. Rostképződés például alacsony pH-értéken, különösen körülbelül 2,0-es pH-nál megy végbe, tehát olyan környezetben, amely jelentős mértékben hozzájárul a glukagon-hidrolízis növekedéséhez. A termék hidrolízise általában csökkenti annak aktivitását. A dezamino-glukagon például a glukagon hormonális hatásának csupán körülbelül 60%-ával rendelkezik. Ezenkívül a rostképződés függ a glukagon tisztaságától. A tisztaság csökkenésével a rost képződés egyre nehezebbé vagy éppen lehetetlenné válik. Mivel a glukagon hajlamos gélesedésre és rostképzésre savas oldatokban, savas glukagon-oldatokkal dolgozó kromatográfiás módszereknél gélesedésből származó glukagon-veszteség és glukagon kicsapódások jönnek létre az oszlopon. Ezen túlmenően, a glukagon hajlamos aggregálódásra savas oldatokban, emellett jelentősen csökken a gél-szűrés (gél-kizárásos kromatográfia) szelektivitása és hatásossága. A 3 875 138 sz. amerikai szabadalmi leírás glukagon rostok képzésére szolgáló, gél-szűréses eljárást ismertet, ahol azonban a reakció egyes műveleteinél a rostok oldatban tartásához hő szükséges. A találmány tárgya eljárás glukagonnak gél-szűréssel történő tisztítására, amelynek során lehetővé válik az eddig ismert eljárásoknál jelentkező hátrányok kiküszöbölése vagy a lehető legkisebbre való csökkentése. A találmány szerinti eljárás segítségével lehetővé válik a glukagon enyhébb körülmények közötti tisztítása, de egyben szelektívebb és, nagyobb glukagon-kitermelést lehet elérni, mint az ismert eljárásokkal (beleértve a fenti amerikai szabadalmi leírás szerinti eljárást is) és nem ütközik semmiféle nehézségbe a rostok oldatban tartása. A találmány szerint a glukagon tisztítását tehát gélszűréssel végezzük, az ezzel kapcsolatban korábban jelentkezett nehézségek nélkül. A találmány szerinti, glukagon tisztítására szolgáló eljárásra az jellemző, hogy száraz állapotban legalább 4 súly% vizet tartalmazó és 100 mikronnál kisebb részecske átmérőjű gélt duzzasztunk, a duzzasztott gélt kromatográfiás oszlopba töltjük, a megtöltött oszlopra 9—11 pH-jú, legalább 0,1 százalék glukagént tartalmazó vizes glukagon-oldatot adunk és a glukagont 4 C° és 40 C° közötti hőmérsékleten olyan vizes eluáló szerrel oldjuk le az oszlopról, amelynek a pH-ja megegyezik az oszlopra vitt glukagon-tartalmú oldat pH-jával. Az oszlopra vitt glukagon-oldatnak 10 súly%-nál kevesebb az összes protein-tartalma, a szilárd proteinre vonatkoztatva. Az oszlopra vitt összes glukagon mennyisége olyan nagyságú, hogy 0,01—5 g/liter ágytérfogat oszlopterhelést biztosít. A leírásban használt „tisztítás” kifejezést tág értelemben használjuk, például ez a megjelölés azt jelenti, hogy bármilyen formában, szilárd vagy vizes oldatban levő nem tiszta glukagon glukagon-tartalma megnő az öszszes szilárd proteinhez viszonyítva. így a glukagontisztaság, amelyet a glukagon és az. összes szilárd protein arányaként (szokásosan százalékos tisztaságként) adunk meg, növekszik. A glukagonnak monodezamido-glukagonná történő hidrolízise a találmány szerinti eljárás foganatosításánál érdekes módon nem jelent problémát, bár a glukagon alkalikus körülmények között könnyen végbemenő hidrolízise jól ismert [például Annable, Acta Endocrinologica, 77, 706 (1974)]. A csatolt rajz az 1. példában leírt, találmány szerinti eljárásra jellemző eluálási diagram. A diagram mind az optikai sűrűségű, mind a glukagon-tartalmú eluátum képe az elfolyó anyag- (vagy eluátum-) térfogatához viszonyítva. A gél-szűrés röviden egy kromatográfiás módszer egyes anyagok — például proteinek — molekulaméret alapján való szétválasztására. Ennél a módszernél az anyagokat egy gélt tartalmazó oszlopon választjuk szét, amely gél oly módon térhálósodik, hogy pórusok alakulnak ki minden egyes részecskében. Ezek a pórusok meghatározott, mérhető térfogattal rendelkeznek, amely egyenes arányban van a gél duzzadásának mértékével és fordított arányban áll a térhálósodás fokával. Mivel a kisebb molekulák jobban bejutnak ezekbe a pórusokba, mint a nagyobb molekulák, a kisebb molekuláknak az oszlopon való áthaladási ideje hosszabb, az áthaladása lassúbb a nagyobb molekulákhoz viszonyítva, amelyek csak részben vagy egyáltalán nem jutnak be a pórusokba. A találmány szerinti eljárásnál általában minden olyan vízzel duzzasztható gélt alkalmazhatunk, amely megfelel oldott proteinnel együtt történő felhasználásra. Ilyen gél száraz vagy nem duzzadt állapotban legalább 4 súly% vizet tartalmaz és részecskéinek átmérője 100 mikron alatt van. A gél víztartalma előnyösen 4% és 98% között van. A száraz gélrészecskék átmérője előnyösen 80 mikronnál kisebb, különösen kedvező részecskeátmérők 20 mikrontól 80 mikronig terjednek. Alkalmas gélek többek között például a következők : keményítő (ideszámítva a kukoricakeményítőt is), a térhálósodon galaktomannán, a térhálósodott dextrán, agar vagy agaróz, poliakrilamidok, akrilamid és metilén-bisz-akrilamid kopolimerek, metilén-bisz-akrilamidnak viniletilakriláttal és vinilpirrolidinnal alkotott kopolimerjei. Az előnyös gélek a térhálósodott dextránok, így a Sephadex-sorozat anyagai. A találmány szerinti eljárásnál alkalmazásra kerülő oszlop típusának nincs döntő jelentősége. Az oszlop magasságának, átmérőjének vagy alakjának a megválasztása a kívánt üzemeltetési paraméterektől függ. Az oszlop magasságával természetesen csökken az átfolyási sebesség. Megállapított dolog az, hogy az oszlopban levő nyomás egyenesen arányos az oszlop magasságával. Ezokból a szelvényes oszlopforma előnyös. Ilyen a Pharmacia Sectional Column KS—370 jelű oszlopa. A szokásos célokra a 4—6 szelvényes oszlopok nagyon jól megfelelnek. Közelítőleg kielégítő glukagon-tisztítást érhetünk el egy liter ágytérfogatra számítva körülbelül 0,08—3,1 g glukagon oszlopterhelésnél. Ez a terhelési tartomány előnyös. Az oszlopterhelések általában 0,01—5 g/liter ágytérfogat tartományban vannak. Egy adott oszlopra a legkedvezőbb körülmények könnyen meghatározhatók. A gél duzzasztása és az oszlop megtöltése a duzzasztott géllel a szakterületen jól ismert bármilyen módszerrel történhet. A gélt általában az eluáló közegben duzzasztjuk. Más módszer szerint a gélt 30%-os vizes etanolban duzzasztjuk, a duzzasztott részt dekantáljuk és eluáló közeggel pótoljuk. Bármely eredetű tisztítatlan glukagon használható, azzal a feltétellel, hogy legalább 0,1 súly%, előnyösen 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
