179965. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glukagonnak gél-szűréssel történő tisztítására
5 179965 6 legalább 1 súly% glukagont tartalmazzon. A glukagonforrás bármely nyers pankreász-proteinfrakciótól.a részben tisztított glukagon-kristályokig változhat. A tisztítatlan glukagont megsavanyított, előnyösen 3-as pH-jú vízben oldjuk. A pH-t ezután 9—11 értékre 5 állítjuk be kívánság szerint híg, vizes bázissal vagy szerves pufferrel. Más előnyös módszer szerint a tisztítatlan glukagont 9—11 pH-jú alkalikus, vizes közegben oldjuk. Erre a célra alkalmas bázisok például a nátriumhidroxid, káliumhidroxid és az ammóniumhidroxid. Elő- 10 nyös a nátriumhidroxid. Megfelelő szerves pufferek a glicin-nátriumhidroxid és a trisz(hidroximetil)aminometán. Szükség esetén az oldhatatlan anyagot ismert módon eltávolíthatjuk. Ahogy már említettük az oszlopra vitt glukagon-oldat pH-ja 9 és 11 között van. 15 Az előnyös pH-tartomány 9,0-től 10,5-ig terjed. Az oszlopra vitt glukagon-oldat pH-jának és az eluálószer pH- jának nem kell ugyan azonosnak lenni, de előnyös, ha a nagy eltéréseket kerüljük. Az oszlopra vitt glukagon-oldat legalább körülbelül 20 0,01 mg, előnyösen legalább körülbelül 0,05 mg és különösen legalább 0,5 mg glukagont tartalmaz milliliterenként. Az ilyen oldat tartalmazhat 10 százaléknál (súly/ térfogat) kevesebb összes szilárd proteint is. Előnyösen az összes szilárd protein különösen pedig 6%- 25 nál (súly/térfogat) kevesebb. Kívánt esetben az oszlopra vitt glukagon-oldatot pufferolhatjuk, bár a pufferolás nem szükséges. Adott esetben és előnyösen az oszlopra vitt glukagon-oldat tartalmazhat még kétértékű fémion kelátképző szert és valamely stabilizáló szert, amelyeket 30 később az eluáló szerrel kapcsolatban ismertetünk. Kielégítő eredmények elérése érdekében a tisztítatlan glukagont olyan térfogatú oldószerben oldhatjuk, amely kevesebb, mint az elválasztott térfogat, amelyre a későbbiekben visszatérünk. 35 A kromatográfiában a Kd eloszlási koefficienset a mozgó fázisban oldott anyag koncentrációjának és az álló fázisban oldott anyag koncentrációjának az arányaként definiáljuk. A gél-szűrésnél a mozgó fázis a gélrészecskék közötti hézagokban mozgó oldószer, az álló 40 fázis pedig a gél-részecskékben felszívott, például a gcl-részecskék pórusaiban visszatartott oldószer. így a Kd azt a felszívott oldószer-frakciót jelöli, amely behatolhat az oldott anyagba. Valamely oldott anyag Vc eluálási térfogatát Kd segít- 45 ségével a következő egyenlet fejezi ki: Ve=V0+Kd ■ V;, ahol V0 az oszlopban a gélrészecskék közötti összes hézag térfogata és V, a gél részecskékbe felszívott oldószer 50 térfogata. Kd-re kifejezve az egyenlet a következő: Kd=(Ve—V0)/Vj. Abban az esetben, ha a víz sűrűségét egynek vesszük, akkor Vj=aWr, ahol a jelenti a száraz gél súlyát és Wr 55 a víztartalmat (Vj az előzőek szerinti jelentésű). így Kd értéke: Kd = (Ve—V0)/aWr, ez pedig a szakterületen ismert módon kísérlettel meghatározható. 60 Két adott anyagot tartalmazó oldatot véve, az egyes oldott anyagokra az eluálási térfogatok a következők : Ve' = V0+Kd'Vi, V^Vo+Kd'Vj. 65 A Vs elkülönített térfogatot a két oldott anyag eluálási térfogatának a különbsége adja, azaz vs=ve"-vc', Vs=(Kd"—Kd')V;. Az előzőekből kitűnik, hogy két (vagy több) oldott anyag szétválasztásának a mértéke részben az oszlop terhelésétől függ. Mihelyt a kisebb molekulasúlyú oldott anyag mennyisége megközelíti a rendelkezésre álló pórusok határát, a két oldott anyag közötti szétválasztás mértékének szükségszerűen csökkennie keli. A terhelési határokon belül a szétválasztás foka változhat. Egyes esetekben egy nagyobb oszlopterhelés választásával ellensúlyozható a szétválasztás a termelékenység ellenében. Ahogy már említettük, az eluálószer pH-ja 9 és 11 között van. Az előnyös pH-tartomány 9,0-től 10,5-ig terjed, a legelőnyösebb pH pedig 9,5. Az eluálószer szokásosan ugyanolyan típusú bázis vagy puffer-oldat, amilyet az oszlopra vitt glukagonoldat készítésénél használtunk, előnyösen pedig vizes ammóniumhidroxidoldat. Adott esetben és előnyösen az eluálószer legfeljebb 0,01 mól/liter mennyiségben valamely kétértékű fémiont tartalmazó kelátképző szert és/vagy legfeljebb 0,5 térfogat százalék mennyiségben butanolt tartalmaz stabilizáló szerként. Az előnyös butanol-mennyiség 0,1 térfogatszázalék. Ilyen kelátképző szer a következő általános képlettel ábrázolható \N-(CH2)n-(CH)-CH2)p- R2X I Rt /r5-n/ —N-(CH2)r-L R.1 J S ahol Rj és Rs egymástól függetlenül karboximetil-, knrboxietil-, 1—6 szénatomos alkil- vagy 1—6 szénatomos hidroxialkil-csoport ; R2 és R6 egymástól függetlenül karboximetil- vagy karboxieíil-csoport ; R, hidrogénatom, hidroxil-csoport vagy 1—6 szénatomos alkil-csoport; R4 hidrogénatom, karboximetil- vagy karboxieíilcsoport; m értéke 1 és 6 közötti egész szám, n jelentése 0 vagy 1, p jelentése ugyancsak 0 vagy 1, r értéke 2 és 6 közötti egész szám, míg s jelentése 0 és 2 közötti egész szám. A fenti általános képletnek megfelelő kelátképző szerek például a következő vegyületek lehetnek: etiléndiamin-N,N,N ',N '-tetraecetsav, 1,2-diaminopropán-N,N,N',N'-tetraecetsav, 1,3-diamino-2-hidroxipropán-N,N,N',N'-tetraecetsav, dietiléntriamin-tetraecetsav, dietiléntriaminpentaecetsav, hexametiléndiamin-N,N,N',N'-tetraecetsav, N-buíilándiamin-N,N',N'-triecetsav, N,N'-dimetiltetrametiléndiamin-N,N'-diecetsav, N-(2- -hidroxietil)etiléndiamin-N,N',N'-triecctsav, és az etiléndiamin-N,N,N',N'-tetrapropionsav. Az előnyös kelátképző szerek a polimetiléndiaminteíreecetsavak, a legelőnyösebb kelátképző szer pedig az 5íiléndiamin-N,N,N',N'-tetraecetsav (továbbiakban EDTA). A kelátképző szert szabad savként vagy alkálifémsóként vagy ammóniumsóként használhatjuk. Ilyen kelátképző szerek előnyös koncentrációja 0,001 mól. 3
