179788. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új karbapeném-származékok előállítására
15 179788 16 szakember ki tud választani az A271 törzsön kívül más PS—6 és PS—7 antibiotikum termelésére képes mikroorganizmust is. A találmány egy lehetséges kiviteli módja szerint a PS—6 és PS—7 antibiotikumokat az említett antibiotikumok termelésére képes mikroba törzsek, például a Streptomyces sp. A271 micéliuma spóráinak tápanyagot tartalmazó táptalajba történő beoltásával és aerob úton történő tenyésztésével állítjuk elő. Használhatjuk a Streptomycetes által általában hasznosított tápanyagokat, például szénhidrátokat, nitrogénforrásokat, szervetlen sókat. A szénforrások példáiként a következőket soroljuk fel: szénhidrátok, mint glükóz, glicerin, maltóz, szacharóz, melasz, dextrin és keményítő, olajok és zsírok, mint szójababolaj, földimogyoróolaj és disznózsír. A nitrogénforrás példáiként a következőket soroljuk fel: pepton, hús extraktum, szójababliszt, gyapotmagolaj, szárított élesztő, kukoricafőzet, élesztő extraktum, lefölözött tej, kazein, nátriumnitrát, ammóniumnitrát és ammóniumszulfát. A szervetlen sók példáiként a következőket soroljuk fel: káliumhidrogénfoszfát, nátriumklorid, kalciumkarbonát és magnéziumszulfát. Kívánt esetben fémnyomok, mint például kobalt vagy mangán hozzáadhatok a tápanyaghoz. Használhatók olyan tápanyagok is, melyeket a PS—6 és PS—7 antibiotikumokat termelő mikroorganizmusok hasznosítanak. A sterilizálás és fermentálás alatti habképződés elkerülése céljából habosodás elleni szereket adagolhatunk, mint például szilikonolajok, növényi olajok. A fenti tápanyagforrások arányát nem korlátozzuk külön, ez az arány széles határok között változhat. Átlagos képzettségű szakember kisszámú kísérlet alapján meg tudja határozni az optimális összetételű és mennyiségű tápanyagforrást minden PS—6 és PS—7 antibiotikum termelésére képes törzs esetén. A termelt PS—6 antibiotikum mennyisége nő, amenynyiben a Streptomyces sp. A271 tenyésztését olyan táptalajon végezzük, mely valamely aminosavat vagy szerves savat is tartalmaz. Aminosavként 2—10 szénatomszámú semleges aminosavak, különösen valin és leucin használata célszerű, szerves savakként pedig 2—10 szénatomszámú alifás szerves savakat, különösen n-valeriánsavat használhatunk. Az aminosavak közül mind az L-, mind a D-, mind pedig a DL-aminosavak alkalmazhatók, de legelőnyösebb az L-aminosavak használata. A táptalajhoz adott aminosavak, illetve szerves savak mennyiségének kritikus határértéke nincsen, de általában a tenyésztési táptalajra vonatkoztatva előnyösen 0,01—1% (súly/térfogat), legelőnyösebben 0,1—0,5% (súly/térfogat)-ban alkalmazzuk azokat. Az adagolás ideje nincs meghatározva. A vegyületeket a tenyésztés során bármikor hozzáadhatjuk a táptalajhoz. Előnyösen a tenyésztés megkezdésekor vagy a tenyésztés megkezdésétől számított 100 órán belül adagoljuk ezeket a vegyületeket. Az aminosavakat vagy szerves vegyületeket adagolhatjuk egyszerre vagy különböző időközönként részletekben. A táptalajt a tenyésztés megkezdése előtt sterilizálhatjuk. A táptalaj pH-ját a sterilizálás előtt vagy után előnyösen 4—9 értékre, különösen 6—8 értékre állítjuk be. A PS—6 és/vagy PS—7 antibiotikumok termelésére képes törzsek tenyésztését úgy végezhetjük, mint az általában szokásos abban az esetben, ha a streptomycetes termel antibiotikumot. Általában előnyös az aerob körülmények közötti tenyésztés. A tenyésztést legtöbb esetben keverés és/vagy levegő átfúvatás közben végezzük. Bár a nem mozgó állapotban történő tenyésztés, a rázás közben történő tenyésztés, a levegővel történő átfúvatást és keverést magában foglaló víz alatti tenyésztés is alkalmazható, előnyösen a víz alatti tenyésztést alkalmazzuk. A fermentáció hőmérsékletére nincs külön előírás, és olyan hőmérsékleten végezzük, melyen a PS—6 és/vagy PS—7 antibiotikumok termelésére képes törzsek növekedése nem ütközik akadályba és termelődik PS—6 és/vagy PS—7 antibiotikum. Bár a fermentáció hőmérséklete a termelő törzs minőségétől függően változik, a hőmérséklethatár általában 20—40 °C, előnyösen 25—35 °C. A táptalaj pH-ját a fermentáció alatt 4—9, különösen 6—8 értékre állíthatjuk be, hogy a ferméiifációt megfelelően hajthassuk végre. Nagy mennyiségben végzett fermentáció esetén előnyösen oltó-törzset tenyésztünk, és ezzel a tenyészettel beoltjuk a tápanyagot tartalmazó táptalajt, amikoris a tenyésztést víz alatti tenyésztéssel végezzük. A fermentációt általában addig folytatjuk, míg megfelelő mennyiségű PS—6 és/vagy PS—7 antibiotikum gyűlik össze. A fermentáció ideje rendszerint 30— 90 óra közötti, ez az idő függ a táptalaj összetételétől, a fermentáció hőmérsékletétől és a termelő törzs minőségétől. A kívánt antibiotikum termelésére képes törzs jellemzőinek figyelembevételével átlagos képzettségű szakember egyszerű kísérletekkel meg tudja határozni az optimális tenyésztési feltételeket. A fermentációs táptalajban felhalmozódott PS—6 és/vagy PS—7 antibiotikum mennyisége az alább leírt biovizsgálati módszerrel és bioautográfiával történhet. Mivel a fermentációs termékben felhalmozódott PS—6 és/vagy PS—7 antibiotikum vízoldható és nagyrészt a mikrobasejteken kívül található, a fermentáció után előnyösen először valamely ismert módszerrel, mint például szűrés, centrifugálás vagy extrakció, elválasztjuk a sejteket, majd a szűrletből, a felülúszóból vagy az extraktumból izoláljuk az antibiotikumokat. Az antibiotikumok izolálása különböző ismert módszerek szerint történhet. Különösen azok a módszerek alkalmazhatók, melyeket a karbonsav típusú antibiotikumok esetén szoktak alkalmazni. Az alábbi módszerek önmagukban, egymással kombinálva vagy adott esetben többször ismételve alkalmasak a fenti célra. Alacsony pH-érték mellett etilacetáttal vagy n-butanollal történő extrakció, az oldószer-fázisból a vizes-fázisba történő visszaextrahálás magasabb pH-érték mellett; semleges pH-érték mellett metilénkloriddal vagy kloroformmal történő extrakció lipofil kvatemer ammóniumsó, mint például benzalkoniumklorid vagy tetra-n-butil-ammóniumhidrogénszulfát vagy valamely Crownvegyület, mint például NISSO Crown-éter diciklohexil-18-crown-6, NISSO Crown-éter 15-crown-5 (Nippon Soda Co., Ltd.) jelenlétében, majd az oldószer-fázisból semleges vizes fázisba történő visszaextrahálás, mely réteg nátriumjodidot, káliumjodidot tartalmazhat; aktív szénén történő adszorpció, mint például Amberlite XAD (Rohm and Hadd Co.), Diaion HP—20 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.), majd vizes metanol- vagy vizes aceton-oldattal történő eluálás; ioncserélő gyantán tör5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
