179788. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új karbapeném-származékok előállítására
13 179788 14 4. táblázat Az A271 törzs összehasonlítása hasonló tenyészetekkel A szénforrások hasznosítása Szénforrások A271 törzs Actinomyces cremeus ISP 5157 Actinomyces flavidovirens ISP 5150 L-Arabinóz + + + D-Xilóz + + + D-Glükóz + + + D-Fruktóz — + + Szacharóz ± — — Inozit — — + L-Ramnóz + — + Raffinóz — — — D-Mannit — — ~ A fenti táblázatok eredményeiből az alábbi következtetéseket vonhatjuk le. Az aerial mycelium színét illetően az Actinomyces flavidovirens általában fehér, amennyiben sárga, akkor zöldessárga. Ez különbség a találmány szerinti A271 törzzsel szemben. Az Actinimyces cremeus általában kevésbé vöröses árnyalatú halvány narancssárga színű, mint az A271 törzs és ezért különbözik az A271 törzstől. A substrate mycelium színét illetően az Actinomyces flavidovirens halvány sárga, az Actinomyces cremeus világos narancssárga színű a legtöbb esetben, míg az A271 törzs általában világos sárga színű. Ezen túlmenően a különböző táptalajok esetén kapott kísérleti eredmények részletes összehasonlítása azt mutatja, hogy az A271 törzs különbözik a másik két tenyészettől. Az A271 törzs az Actinomyces cremeus-tól a D-fruktóz és L-ramnóz hasznosításában, az Actinomyces flavidovirens-től a D-fruktóz és inozit hasznosításában különbözik. Ezek alapján a találmány szerinti A271 törzs világosan különbözik a hozzá legjobban hasonlító két ismert tenyészettől. Ebből következően az A271 törzs különbözik minden Streptomycetes fajtól és új fajnak tekinthetjük, melynek neve Streptomyces sp. A271. Ezt a tenyészetet Japánban az Agency of Industrial Science and Technology Fermentáción Research Institute-nál letétbe helyeztük és itt a FERM—P No. 3984 számot kapta. Szintén letétbe helyeztünk Streptomyces sp. A271 mintát az ATCC-nél, ahol az No. 31358 számot kapta. A találmány szerinti eljárásban nemcsak magát az A271 törzset, hanem annak természetes és mesterséges mutánsait — melyeket kémiai vagy fizikai kezeléssel hozunk létre — is használhatjuk. A PS—6 és/vagy PS—7 antibiotikumok termelésére képes mikroorganizmusok a mikroorganizmusok széles körét ölelik fel és nem korlátozzuk azokat egy bizonyos nemzetségre. A PS—6 és/vagy PS—7 antibiotikumok termelésére képes mikroorganizmusok kiválasztását az alábbi módszerrel átlagos képzettségű szakember el tudja végezni. Talajból izolált, mikroorganizmusok tenyésztési táptalajának szűrletét p-laktamáz-érzékeny mikroorganizmussal beoltott biológiai vizsgálat céljára szolgáló agarlemez és egy másik, ugyanazzal a mikroorganizmussal beoltott, S-laktamázt tartalmazó biológiai vizsgálat céljára szolgáló agar-lemez alkalmazásával analizálunk. A táptalajszűrletből azokat a mikroorganizmusokat választjuk ki a további munka céljára, melyek az utóbbi lemezen kisebb gátló zónát mutatnak, mint az előbb említetten. Ezután a fenti módszerrel kiválasztott mikroorganizmusok tenyésztési táptalajában levő aktív komponenseket aktív szénén adszorbeáljuk, majd eluáljuk. Az összegyűjtött eluátumot papírkromatográfiával vagy vékonyréteg-kromatográfiával kifejlesztjük, mely után valamely vizsgálati organizmusként szolgáló fi-laktámérzékeny mikroorganizmussal történő bioautográfi^ következik. A mikroorganizmusok kiszűrésére szolgáló módszert még közelebbről mutatjuk meg a következő példával. A (i-laktám-érzékeny organizmussal beoltott biológiai vizsgálat céljára alkalmas lemezként Comamonas biovizsgálati lemezt használunk. A lemezről részletes leírást később adunk. A Comamonas CV és Comamonas CM biovizsgálati lemezeket úgy állítjuk elő, hogy a fenti Comamonas biovizsgálati lemezhez hozzáadjuk a Proteus vulgaris P—5, illetve Citrobacter freundii E—9 által termelt S-laktamázt. 8 mm átmérőjű cellulózlemezeket, melyekhez előzőleg hozzáadtuk a talajból izolált mikroorganizmusok tenyésztési táptalajának szűrletét, ráhelyezünk a fenti biovizsgálati lemezekre és 35 °C hőmérsékleten 20 órán keresztül inkubáljuk. Az inkubáció után kiválasztjuk azokat a mikroorganizmusokat, melyek táptalajszűrletei gátló zónát mutatnak a Comamonas lemezen és ennél kisebb gátló zónát adnak a Comamonas CV vagy Comamonas CM lemezeken. Ezeknek a mikroorganizmusoknak a táptalajához hozzáadunk 2% (súly/térfogat) aktív szenet („Tokusei Shirasagi, Takeda Chemical Industries, Ltd.) és 15 percig tartó keverés után az oldhatatlan anyagot centrifugálással összegyűjtjük. Az oldhatatlan anyagot ugyanolyan mennyiségű desztillált vízzel mossuk, mint amennyi táptalaj szűrletet használtunk, és ismét centrifugáljuk. A mosott oldhatatlan anyagot 30 percig szobahőmérsékleten történő keverés útján a felhasznált táptalajszűrlet mennyiségére vonatkoztatott fele mennyiségű 50%-os (térfogat/térfogat) vizes acetonnal eluáljuk. Centrifugálás után a felülúszót 30—50 °C hőmérsékleten forgó rendszerű bepárlóberendezésben a táptalaj szűrlethez viszonyított 20-szoros töménységű oldatra pároljuk be. A betöményített oldatot leszálló papírkromatográfiás vizsgálatnak vetjük alá (Toyo Filter Paper, Toyo Roshi Kaisha Ltd.), a kromatogramot 16 órán keresztül 80% acetonitril/trisz/EDTA oldószerben [összetétele 120 ml acetonitril, 30 ml 7,5 pH-jú, 1/10 M trisz-(hidroximetil)-aminometán-hidroklorid puffer, 1 ml vizes etiléndiamintetraecetsav-nátrium-só] fejlesztjük ki. Ezután Comamonas terrigena B—996-tal, mint vizsgáló organizmussal történő bioautográfia következik. Azokat a talajból izolált mikroorganizmusokat választjuk ki PS—5 antibiotikum termelésére képes mikroorganizmusokként, melyek biológiailag aktív termékei ugyanolyan migrációs távolságban (vagy ugyanolyan Rf értéknél) adnak gátló zónát, mint a PS—5 antibiotikum. Az így kiválasztott mikroorganizmusokat a későbbiekben további vizsgálatnak vetjük alá, hogy igazoljuk PS—5 antibiotikum-termelő képességüket. Ezt a vizsgálatot papír és vékonyréteg-kromatográfiával végezzük. A fenti módszer felhasználásával átlagos képzettségű 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
