179788. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új karbapeném-származékok előállítására
29 179788 30 Magnézium-szulfát 0,05% (súly/térfogat) Kalcium-karbonát 0,3% (súly/térfogat) Kobaltklorid 0,00013% (súly/térfogat) a sterilizálás előtt a pH=7,0 6. példa A 2. példában leírtakkal analóg módon végezzük a tenyésztést, azzal az eltéréssel, hogy DL- vagy L-valin helyett n-valeriánsavat adunk a táptalajhoz. A tenyészetet 72 órán keresztül rázzuk. A táptalajban összegyűlt PS—6 antibiotikum mennyisége négyszerese annak a mennyiségnek, mely akkor gyűlik össze, ha a táptalajhoz nem adunk n-valeriánsavat. 7. példa A tenyésztést a 3. példában leírtakkal analóg módon végezzük, azzal az eltéréssel, hogy DL- vagy L-valin helyett n-valeriánsavat adunk a táptalajhoz. Az összegyűlt PS—6 antibiotikum mennyisége kétszerese annak a mennyiségnek, mely akkor gyűlik össze, ha a táptalajhoz nem adunk n-valeriánsavat. 8. példa A tenyésztést az 5. példában leírtakkal analóg módon végezzük, azzal az eltéréssel, hogy L-valin helyett n-valeriánsavat adunk a táptalajhoz. A táptalajban öszszegyűlt PS—6 antibiotikum mennyisége négyszerese annak a mennyiségnek, mely akkor gyűlik össze, ha a táptalajhoz nem adunk n-valeriánsavat. 9. példa Az 1. példában leírtak szerint készített oltótenyészet 0,01 ml-ét 15 1 fent említett összetételű SE—4 táptalajt tartalmazó 301-es fermentátorba töltjük. Kényszer levegőátfúvatás közben 28 °C hőmérsékleten, 24 órán keresztül, 200 ford/perc fordulatszám mellett végezzük a tenyésztést. A steril levegőt 7,5 1/perc sebességgel tápláljuk be. 200 1 űrtartalmú rozsdamentes fermentátorban 100 1, fenti összetételű AGB—42 táptalajba (a beoltás előtt 0,5% L-valint adunk a táptalajhoz) beoltjuk az így kapott táptalajt, és kényszer levegőátfúvatás közben 28 °C hőmérsékleten, 72 órán keresztül, 100 ford/perc fordulatszám mellett végezzük a tenyésztést. A táptalajból centrifugált felülúszó antibiotikus hatása 450 CCU/ml. A táptalajhoz a szűrés megkönnyítése céljából hozzáadunk 3%-os (súly/térfogat) perlit-oldatot Topco Perlite, Topco No. 34, Toko Perlite Kogyo K. K.) és szűrőprésen szűrjük. így 60 1 szűrletet kapunk (összes antibiotikus hatása 25,5 x 106 CCU). Az alábbi műveleteket 6 °C hőmérséklet alatt végezzük. A szűrletet 6 1 Diaion PA—306 ioncserélő gyantát (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) tartalmazó oszlopon adszorbeáljuk. Az oszlopot 20 1 5%-os (súly/térfogat) nátriumklorid-oldattal eluáljuk és így a PS—5 és PS—6 antibiotikumokat tartalmazó (A) aktív frakciót kapjuk (összes antibiotikus hatás 4,2 x 106 CCU). Erről az oszlopról izoláljuk később a PS—7 antibiotikumot. Az (A) aktív frakciót rávisszük Diaion HP—20 gyanta (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) (3 x70 cm) oszlopra és 10%-os vizes aceton-oldattal eluáljuk. Az eluátumot csökkentett nyomáson az aceton ledesztillálásáig bepároljuk és előzőleg 1/100 foszfát-pufferral 8,0 pH értékre beállított QAE-Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals Co.) (2,4 x 22 cm) oszlopon vezetjük át, majd lineáris nátriumklorid koncentráció gradiensű 1 és 0,4 M közötti nátriumkloridot tartalmazó M/100 foszfát-puffer-oldattal eluáljuk és az eluátumot 10 g-os frakciókban összegyűjtjük. Az összegyűjtött frakciókat 100-szorosra hígítjuk, majd az ultraibolya abszorpciós spektrum vizsgálata és a biovizsgálat elvégzése után az aktív frakciókat összegyűjtjük. Az aktív frakciót a PS—5 antibiotikum eltávolítása.céljából Daioin HP—20 AG (1,2x40 cm) oszlopra visszük és 300 ml, lineáris metanol koncentráció gradiensű 10 és 75% közötti koncentrációjú vizes metanol-oldattal eluáljuk. A frakciók súlya 4 g. Minden frakcióval leszálló papírkromatográfiás vizsgálatot végzünk [a kromatogramot a következő oldószerelegyben fejlesztjük ki: 120 ml acetonitríl, 30 ml 1/10 M trisz-(hidroximetil)-aminometán-hidroklorid puffer (pH=7,5) és 1 ml 1/10 M vizes etiléndiamintetraecétsav-nátriumsó-oldat (pH=7,5)] és elvégezzük a bioautográfiai vizsgálatot. A No. 25—30, PS—5 antibiotikumot és a No. 33—40, PS—6 antibiotikumot tartalmazó aktív frakciókat összegyűjtjük. A PS—6 antibiotikumot tartalmazó aktív frakciót a metanol ledesztillálásával koncentráljuk, majd fagyasztva szárítjuk. Az így kapott liofilizált készítményt feloldjuk 1 ml M/100 foszfát-puffer-oldatban (pH=8,0), majd Sephadex G—10 (Pharmacia Fine Chemicals Co.) oszlopon (1,2x80 cm) vezetjük át tisztítás céljából és a kromatogramot ugyanezzel a pufferral fejlesztjük ki. Az aktív frakciókat összegyűjtjük és híg vizes nátriumhidroxid-oldattal a pH-t 8,3 értékre állítjuk be, majd a frakciókat Diaion PH—20 gyanta (Mitsubishi Chemicals Industries Ltd.) oszlopra (1,2x20 cm) visszük. Az elúciót kisózás céljából 10%-os vizes aceton-oldattal végezzük. Az aktív frakciót összegyűjtjük és fagyasztva szárítjuk, így 2,4 mg fehér liofilizált készítményt kapunk, mely a PS—6 antibiotikum nátrium-sója. A nátriumklorid-oldattal eluált Diaion PA—-306 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) oszlopot, melyet a PS—7 antibiotikum izolálása céljából tettünk félre, 50%-os (térfogat/térfogat), 3% (súly/térfogat) nátriumkloridot tartalmazó vizes metanol-oldattal eluáljuk, így kapjuk a (B) aktív frakciót (összes mikrobaellenes hatása 1,1 x x 106 CCU, 4,3%-os kitermelés). A (B) aktív frakció eluátumát a metanol eltávolítása céljából csökkentett nyomáson bepároljuk, majd Diaion HP—20 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) oszlopon (3 cm 0 x 70 cm) adszorbeáljuk és 10%-os (térfogat/térfogat) vizes aceton-oldattal eluáljuk. Az eluátumot 25 g-os adagokra osztjuk. Az aktív frakciókat egyesítjük és az aceton eltávolítása céljából csökkentett nyomáson bepároljuk. A koncentrátumot előzőleg M/1000 foszfát-pufferrel 8,0 pH értékre beállított QAE-Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals AB) oszlopon (2,5 cm 0 x30 cm) adszorbeáljuk és lineáris nátriumklorid koncentráció gradiensű 0,1 és 0,7 M közötti nátriumkloridot tartalmazó M/100 foszfát-pufferral eluáljuk. Az eluátumot 17 g-os frakciókra osztjuk. Minden frakciót biovizsgálatnak és papírkromatográfiás vizsgálatnak vetünk alá, melyet bioautográfiai vizs-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
