179788. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új karbapeném-származékok előállítására
31 179788 gálát követ. A No. 25—33 frakciókat összegyűjtjük, ezek tartalmazzák a PS—7 antibiotikumot. A fenti aktív frakciót Diaion HP—20 AG (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) oszlopon (1,1 cm 0 x x 20 cm) adszorbeáljuk, majd 400 ml, lineáris gradiensű 5 0 és 10% közötti koncentrációjú aceton oldattal eluáljuk. Az eluátumot 5 g-os frakciókra osztjuk. Minden frakciót 50-szeresére hígítunk és elvégezzük az ultraibolya abszorpciós spektrum vizsgálatát. A PS—7 antibiotikumot tartalmazó No. 15—20 frakciókat összegyűjtjük 10 és liofilizáljuk, így a nyers PS—7 antibiotikumot kapjuk. Az így kapott PS—7 antibiotikumot tartalmazó liofilizált nyers készítményt a PS—7 antibiotikum további tisztítása céljából feloldjuk 8,0 pH-értékű M/100 fősz- 15 fát-puffer-oldatban, majd Sephadex G—10 (Pharmacia Fine Chemicals AB) oszlopra (1,2 cm 0 x 80 cm) viszszük és a kromatogramot az előbb említett foszfátpuffer-oldattai fejlesztjük ki. Az aktív frakciókat összegyűjtjük és előzőleg M/100 foszfát-pufferral 8,0 pH- 20 értékre beállított QAE-Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals AB) oszlopon adszorbeáljuk és 200 ml lineáris nátriumklorid koncentráció gradiensű 0 és 0,4 M közötti koncentrációjú nátriumklorid-oldattal eluáljuk. Az így kapott aktív frakcióhoz hozzáadunk 3% (súly/tér- 25 fogat) nátriumkloridot. Az oldatot Diaion HP—20 AG (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) oszlopon (1,1 cm 0 x 20 cm) adszorbeáljuk, majd az aktív komponenst 10%-os (térfogat/térfogat) vizes aceton-oldattal eluáljuk és kisózzuk. Az aktív frakciót liofilizáljuk és így 30 kapunk 1,5 mg fehér liofilizált készítményt, mely a PS—7 antibiotikum nátrium-sója. Hasonló eljárások ismétlésével megkapjuk a készítményeket. A fentiek szerint előállított PS—6 és PS—7 antibioti- 35 kumok nátrium-sói az alábbi fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek. I. PS—6 antibiotikum 1. Szín Színtelen 2. Oldhatóság Oldható vízben, teljesen oldhatatlan acetonban. 3. Bomláspont 40 45 50 Spectrophotometer (Hitaci, Ltd.) berendezésben vizsgáljuk. A felvett diagram az 1. ábrán látható. A jellemző értékek az alábbiak: X“;n°=243,0 nm X»?°=300,0 nm A készítmény desztillált vízben készített oldatához hozzáadunk hidroxilamin-oldatot (pH=7,5). Az így kapott oldatban a PS—6 antibiotikum koncentrációja 20 pg/ml, a hidroxilamin koncentrációja 10 mM. 30 percen keresztül 22 C hőmérsékleten történő állás után az oldat 300,0 nm-nél mért optikai sűrűsége az eredeti értéknek mintegy 95%-ával csökken. 5. Infravörös abszorpciós spektrum A PS—6 antibiotikum nátrium-sójának káliumbromídban Hitaci Infrared Spectrophotometer Model 215 berendezésen (Hitaci, Ltd.) felvett infravörös spektrumát a 2. ábra mutatja. A megadott hullámszámoknál az alábbi jellemző abszorpciós maximumok találhatók: (i) 1760 cm-1 (S-laktám gyűrű —CO— csoportja) (ii) 1660 cm-1 (amid kötés —CO— csoportja) (fii) 1600 cm“1 (—COOe csoport) (iv) 1555 cm“1 (amid kötés —CO—NH— csoportja) 6. Proton magmágneses rezonancia spektrum A PS—6 antibiotikum-nátrium-sójának proton magmágneses rezonancia spektrumát 100 MHz-en nehéz vízben JEOL NMR spectrometer JNM PS—100 berendezésen (Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.) vizsgáljuk (3. ábra). A görbe alapján jellemzők a következők : (i) két dublett, melynek központja 0,94 és 0,98 ppmnél van (J = 7,0 Hz) CH •\ CH,/ CH(ii) éles szingulett 1,92 ppm (CH3—CO—) ] (ifi) multiplett 2,42—3,50ppm-nél(—CH2—,—CH—) (iv) multiplett 3,90—4,20 ppm-nél N (—CH—) 7. Színreakció Ehrlich-reagens reakció: pozitív Jód-klórplatinasav reakció: pozitív Ninhidrin reakció: negatív 8. Papirkromatográfia A készítményt Kofler-típusú BY—1 mikro-olvadáspontmérő berendezésben (YAZAWA Scientific Mfg, Co., Ltd.) vizsgáljuk. A hőmérsékletet percenként 1 °C- kal emeljük. A minta nem egy meghatározott hőmérsékleten olvad. 143 °C hőmérsékleten lágyulni kezd, fokozatosan barna színű lesz és 165 °C hőmérsékleten térfogata csökkenni kezd. 220 °C hőmérséklet körül barna gyantát kapunk. 4. Ultraibolya abszorpciós spektrum 60 ;zg PS—6 antibiotikum-nátrium-sót feloldunk 3,0 ml vízben és 200—20 típusú Hitaci Double-beam A PS—6 antibiotikum Toyo Filter Paper No. 50 (Toyo Roshi Kaisha Ltd.) papíron végzett leszálló pa- 55 pírkromatográfiás vizsgálat során a következő Rf értékeket mutatja az alább felsorolt oldószerek alkalmazása esetén : acetonitril/trisz-puffer/EDTA Rf= 0,41 (1. számú megjegyzés) 60 etanol/víz (7/3) Rf=0,65 [(1. számú megjegyzés: az oldószerelegy a következő összetételű: 120 ml acetonitril, 30 ml 1/10 M trisz-(hidroximetil)-aminometán-hidroklorid-puffer-oldat (pH=7,5) és 1 ml 1/10 M etiléndiamintetraecetsav-nát- 65 rium-só (pH = 7,5)]. 16
