179663. lajstromszámú szabadalom • Eljárás D-alfa-aminosavak előállítására
5 í79663 6 szacharóz + „Polysorbate 80"levulínát — malonátcitrakonát-tesztoszteronmezo-tartarátcellobióz-D(—)-taríarát — DL-béta-hidroxivasav + szorbit L-hisztidin — mezakonátpantoténsav — eritrit-acctát + 2,3-butylenglycoiszukcinát — m-benzoesavcifrát — p-benzoesav-L-ornitin _L. triptamin-5-keto-glukonát + alfa-amilamin-L-lizin-f-DL-tejsav + L-alanin — D-fruktúz + dulcit — 28. GC-tartalom DNA-ban: 60,6% 29. K étbázisú aminosav a sejtfalban: lizin A fent említett mikrobiológiai jellemzők alapján az AJ 11 223 Arthrobacter nemzetséghez tartozik. Az AJ 11 223-at nem lehet azonosítani az Arthrobacter nemzetség egyetlen ismert fajával sem a sejtfalban levő aminosav, a zselatin-bontás, a mozgékonyság, a vitaminszükséglet és a keményítő-bontás miatt. Így tehát az AJ 11 223-at az Artherobacter nemzetség egyik új fajának kell tekinteni. Ezt a fajt Artherobacter fragilusnak neveztük el. A találmány szerinti eljárással igen sokféle 5-szubsztituált hidantoint lehet D-alfa-aminosavvá alakítani, így a kiindulási anyagként használt hidantoinok 5-helyzetű szubsztituense széles határok között változhat. Ezt a szubsztituenst azonban természetesen úgy kell megválasztani, hogy az enzimes reakció során optikailag aktív D-alfa-aminosav izomer képződjön. A találmány szerinti eljárásban kiindulási vegyületként az alábbi 5-helyzetű szubsztituenseket tartalmazó hidantoinokat használhatjuk: 1. egyenes vagy elágazó láncú vagy gyűrűs telített alifás szénhidrogéncsoport, például metil-, etil-, propil-, izopropil-, izobuti!-, l-metil-propíl-, terc-butil-, ciklohexil- és ciklopentilcsoport, 2. egyenes vagy elágazó láncú vagy gyűrűs telítetlen alifás szénhidrogéncsoportok, például 2-propeniI-, 2- -propinil-, 1-ciklohexenil- vagy 1,4-ciklohexadienilcsoport, 3. egyenes vagy elágazó láncú vagy gyűrűs telített vagy telítetlen, egy vagy több hidrogénatom helyén szubsztituenst tartalmazó alifás szénhidrogéncsoportok, például további szubsztituensként hidroxil-, karboxil-, szulfhidril-, alkilmerkapto-, amino-, alkilamino-, alkoxi-, karbamoil-, guanidino-, ureido-, szulfoxi-, nitro-, halogén-, acil-, aminoszulfenil-, arilmerkapto-, 4-imidazolil- vagy 4-tienil-csoportot tartalmazó csoportok, 4. aromás szénhidrogéncsoportok, például fenil- vagy naftilcsoport, 5 5. egy vagy több hidrogénatom helyén szubsztituenst tartalmazó aromás szénhidrogéncsoportok, amelyekben a további szubsztituens alkil-, alkenil-, gyűrűs alkil- vagy alkenil-, hidroxil-, alkoxi-, halogén-, benziloxi-, benziloximetiloxi-, metiloxi-metiloxi-, aciloxi-, acil-, ariloxi-, aminoszulfenil-, trifluormetil-, alkilmerkapto-, amino-, acilamino-, alkilamino-, nitro-, karboxil- vagy karbamoilcsoport, 6. heterociklusos csoportok, például 2-tienil-, 5-tiazoiil-, 4-imidazolil- vagy 2-furilcsoport vagy 7. egy vagy több hidrogénatom helyén szubsztituenst tartalmazó heterociklusos csoportok, amelyek további szubsztituensei azonosak az 5. pontban felsorolt szubsztituensekkel. Eta a fenti mikroorganizmusokat a szokásos tápközegekben tenyésztjük, akkor a mikroorganizmusok sejtjeiben túlnyomórészt a hidantoinokat D-alfa-aminosavakká átalakító enzim termelődik, és csekély mennyiségben jelen van a tápközeg felső fázisában. A tápközeg tartalmazhat szénforrást, nitrogénforrást, szervetlen ionokat és szükség esetén kisebb mennyiségben szerves tápanyagokat. Ela a tápközeg csekélyebb mennyiségű 5-szubsztituált hidantoint tartalmaz, akkor általában sokkal nagyobb enzimaktivitáshoz jutunk. Szénforrásként használhatunk például szénhidrátokat, így glükózt vagy szacharózt, szerves savakat, így ecetsavat, alkoholokat, így etilalkoholt, valamint szénhidrogéneket. Nitrogénforrásként előnyösen ammóniát vagy karbamidot használunk. Szervetlen ionok forrásaként megfelelőnek találtuk például a foszfátokat és a magnézium-, vas-, kalcium- és káliumsókat. Szerves tápanyagként használhatunk például vitaminokat, aminosavakat, vagy a szerves tápanyagokat tartalmazó nyersanyagokat, így például az élesztökivonatot, peptont, bouillont, vagy kukoricalekvárt. A tenyésztést 4 és 8 közötti pH-értékné! és előnyösen 25—40 C hőmérsékleten aerob körülmények között végezzük. Az enzim képződése általában fél naptól két napig terjedő tenyésztési idő alatt lezajlik a sejtekben. Enzimforrásként tehát a sejteket és intakt sejteket tartalmazó tápközeget használhatjuk. Előnyösen használhatjuk azonban enzimforrásként a sejtek homogenizátumát vagy az ultrahanggal kezelt, szerves oldószerekkel, például acetonnal fagyasztva szárított sejteket is. Használhatjuk továbbá enzimforrásként a proteinfrakciót, amelyet a sejtek homogenizátumából vagy az ultrahanggal kezelt sejtekből a szokásos módszerekkel, például gélszűréssel vagy kisózással különíthetjük el. A sejteket vagy az egyéb enzimforrásokat használhatjuk előzetes rögzítés után is. Feltételezésünk szerint az 5-szubsztituált hidantoinok D-alfa-aminosavakká való átalakításában több enzim is részt vesz. Az 5-helyzetben szubsztituált hidantoinokat oly módon alakítjuk át D-alfa-aminosavakká, hogy az 5-heIyzetben szubsztituált hidantoint a mikroorganizmus tenyésztése közben érintkezésbe hozzuk a mikroorganizmus sejtekkel. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy az 5-helyzetben szubsztituált hidantoint különféle reakcióközegekben hozzuk érintkezésbe a sejtekkel vagy az enzimforrással. Ha az 5-helyzetben szubsztituált hidantoint a íápközegben érintkeztetjük a sejtekkel, akkor a hidantoint előnyösen a mikroorganizmus részleges vagy teljes elszaporítása után adjuk a tápközeghez. Célszerűen úgy dolgozunk, hogy a hidantoint szakaszosan, kis részletekben adjuk a tápközeghez. így biztosítjuk, hogy a hidantoin ne dúsuljon fel túlságosan a tápközegben, mert a hidantoin feldúsulása gátolná a mikroorganizmusok növekedését. A tenyésztést addig folytatjuk, amíg azt tapasztaljuk, hogy a hidantoin már nem alakul át D-alfa-aminosavvá. Az 5-helyzetben szubsztituált hidantoint olyan reakcióelegyben érintkeztetjük a sejtekkel vagy az enzimforrással, amely a D-alfa-aminosav hozamának növelése 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
