179663. lajstromszámú szabadalom • Eljárás D-alfa-aminosavak előállítására
7 179663 8 végett adott esetben antioxidánsokat, felületaktív anyagokat, koenziineket és/vagy hidroxüamint tartalmaz. A reakcióelegv hőmérsékletét 10 =C és 70 CC között, pH-ját 4 és 9 között tartjuk, és a reakciót 5- 100 órán át folytatjuk. A tápközegben felhalmozódó D-alfa-aminosav kinyerését, illetve a reakcióelegy feldolgozását a szokásos módon könnyen elvégezhetjük. így eljárhatunk például ioncserélő gyanták felhasználásával, vagy kicsaphatjuk az aminosavat annak izoelektromos pontján, minthogy igen csekély mennyiségű L-izomer képződik az alfa-amínosavból. A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg közelebbről az oltalmi kör korlátozása nélkül. Az alábbi példákban bemutatott D-a!fa-aminosavak mennyiségi meghatározását úgy végeztük, hogy az aminosavat szűrőpapíron 2:1:1 arányú n-butanol— ecetsav—víz eleggyel futtattuk és a papírt ninhidrinoldattai permeteztük be. Az elszíneződést 570 jim-nél mértük 50°ó-os etanollai való extrakció után. A menynyiségi analízist folyadék-kromatográfiával folytattuk. A D- és L-izomerek mennyiségét a termék optikai forgatóképessége alapján határoztuk meg. I. példa 7,0 pH-jú vizes tápközeghez, amely deciliterenként 0,5 g glükózt, 0,5 g ammóniumszulfátot, 0,1 g káliurn-dihidrogénfoszfátot, 0,1 g dikálium-hidrogénfoszfátot, 0,05 g magnéziumszulfát heptahidrátot, 1 mg ferroszulfát heptahidrátot, 1 mg mangánszulfát tetrahidrátot és 1,0 g élesztőkivonatot tartalmaz, 0,2 g DL-5-metilmerkaptoetil-hidantoint adunk. A tápközeg 50 ml-es részeit 500 ml-es edényekbe helyezzük, amelyeket rázás közben 15 percig sterilizálunk 120 'C-on. Ferde bouillon agaron 30 °C-on 24 órán át tenyésztett AJ 11 149, AJ 11 150, AJ 11 151, illetve AJ 11 152 jelű törzs tenyészetéből egy oltókaccsa! kivett inokulumot juttatunk mindenegyes tápközeg-frakcióba. A tenyésztést 30°C-on 20 órán át folytatjuk rázás közben. A tápközegben képződő sejteket kicentrifugáljuk és a tápközeggel azonos térfogatú fiziológiás sóoldattal mossuk. Az így kapott sejteket (5 g/dl) 0,1 mólos (pH 8,0) foszfátpuffer mintákban szuszpendáljuk, amelyek mindegyike 1 g/dl 5- szubsztituált hidantoint tartalmaz az 1. táblázatban megadott felsorolás szerint (a végső térfogat 5 ml). Mindegyik reakcióelegyet 30 cC-on tartjuk 16 órán át. A reakcióelegyben képződő D-alfa-aminosavak rnenynyiségét és optikai forgatóképességét a fent említett módszerrel határoztuk meg. A meghatározás előtt a tápközegben levő ciszteint és homociszteint cisztinné, illetve homocisztinné oxidáltuk. A kapott eredményeket az 1. táblázatban közöljük. 2. példa Achromobacter liquefaciens AJ 11 198 és Alcaligenes aquamarinus AJ 11 199 törzseket az 1. példához hasonló módon tenyésztünk egy olyan vizes tápközegben, ameiy deciliterenként 2 g glükózt, 0,5 g ammóniumszulfátot, 0,1 g kálium-dihidrogénfoszfátot, 0,1 g dikálium-hidrogénfoszfátot, 0,05 g magnéziumszulfát heptahidrátot, 1 mg ferroszulfát heptahidrátot, 1 mg mangánszulfát tetrahidrátot, 1,0 g élesztőkivonatot, 0,2 g DL-5-metilmerkaptoetil-hidantoint és 4,0 g külön sterilizált kalciumkarbonátot tartalmaz. A tápközeg pH-ját 7,0-ra állítjuk be. Az így kapott sejteket 0,1 mólos foszfátpufferben érintkeztetjük a második táblázatban felsorolt 5-szubsztituált hidantoinokkal. Ezt a műveletet az 1. példa szerinti módon végezzük. A kapott eredményeket a 2. táblázatban mutatjuk be. 3. példa Egy deciliterenként 2,0 g glükózt, 0,5 g ammóniumszulfátot, 0,1 g kálium-dihidrogénfoszfátot, 0,1 g dikálium-hidrogénfoszfátot, 0,05 g magnéziumszulfát heptahidrátot, 1 mg ferroszulfát heptahidrátot, 1 mg mangánszulfát tetrahidrátot, 1,0 g élesztőkivonatot, 1,0 g peptont, 0,2 g DL-5-metilmerkaptoetil-hidantoint és 4,0 g előzetesen sterilizált kalciumkarbonátot tartalmazó vizes tápoldat pH-ját 7,0-ra állítjuk be. A tápoldat 50 ml-es részleteit 500 ml-es edényekbe helyezzük és 120 cC-on sterilizáljuk 15 percig. Ezután ferde buoillon agaron 30 órán át tenyésztett Moraxeila nonliquefaciens AJ 11 221, Paracoccus denitrificans AJ 11 222 és Arthrobacter fragilus AJ 11 223 törzsekből oltókaccsal kivett inokulumot viszünk át a vizes tápoldat fent említett szétosztott részleteibe. A második tenyésztést 30 °C-on folytatjuk 20 órán át, miközben az edényeket rázzuk. Az így kapott sejteket kicentrifugáljuk, és a tápközeggel azonos térfogatú fiziológiás sóoldattal mossuk. A 3. táblázatban felsorolt 5- szubsztituált hidantoinokat ezután az 1. példában ismertetett módon alakítjuk át D-alfa-aminosavakká. Az eredményeket a 3. táblázatban adjuk meg. A kapott aminosavakat elkülönítjük és tisztítjuk, optikai forgatóképesség-méréssel igazoljuk, hogy D- alakban kaptuk a terméket. 4. példa Pseudomonas caryophylli AJ 11 150 törzset az 1. példában megadottakhoz hasonlóan tenyésztünk, és a kapott kultúrát lecentrifugáljuk. Az elválasztott sejteket fiziológiás sóoidattal mossuk. 25 g sejtet 500 ml 0,1 mólos foszfátpufferben (pH=8,0) szuszpendálunk, amely 5 g D-5-(p-hidroxifenil)-hidantoint, illetve egy másik minta esetében 5 g L-5-(p-hidroxifenil)-hidantoint tartalmaz. Mindegyik reakcióelegyet 30 cC-on tartjuk 27 órán át. Ezután a reakcióelegyből centrifugálással eltávolítjuk a sejteket, és a folyadékot ultraszűrőn szűrjük. A szűrletekben levő p-hidroxifenil-glicint hidrogén formájú kationcserélő gyantára (Diaion SK—1B) viszszük és 1 n ammóniumhidroxiddal eluáljuk. Az eluátumot bepároljuk, hűtjük, az így kapott kristályokat ezután víz—etanol elegybő! való átkristályosítássa! tisztítjuk. A D-5-(p-hidroxifenil)-hidantoin átalakítása során 3,04 g kristályos terméket, míg az L-5-(p-hidroxifenii)-hidantoin átalakítása után 3,20 g kristályos terméket kapunk. A kristályos termék a vizsgálat során az NMR spektrum, a vékonyréteg-kromatogram és a papírkromatogram Rf értékei, valamint az optikai forgatóképesség alapján azonosnak bizonyult az autentikus D-p-hidroxifenilglicin mintával. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
