179657. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eszterasztin és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
15 179657 16 csökkentett nyomáson szárazra pároltuk és így 3 g barna port kaptunk. A por IDJ0 értéke észterázra 0,07 mcg/ml. 3. példa Streptomyces MD4—Cl törzset 3 napig tenyésztettünk az 1. példában leírt táptalajban és tenyésztési és inkubációs feltételek mellett és így 10 liter fermentlé szűrletet kaptunk, melyet 1 liter Amberlite XAD—4 (abszorbens gyanta, Rohm and Haas Co. USA) oszlopon engedtünk keresztül és így a gyanta adszorbeálta az eszterasztint. A gyanta oszlopról lefolyó anyag nem mutatott észteráz gátló hatást. Az adszorbeált eszterasztint úgy nyertük vissza a gyantáról, hogy 2 liter metanollal eluáltuk. A metanolos eluátumot 20 g-os frakciókban kaptuk és az aktív frakciókat összeöntöttük és csökkentett nyomáson szárazra pároltuk és így 160 mg eszterasztin nyers port kaptunk (ID50=0,03 mcg/ml) termelés: több, mint 90%. 4. példa Streptomyces MD4—Cl törzs 3 napig tartó inkubálásával kapott tenyészetet, amelyet az 1. példában leírt módon és azonos táptalajon kaptunk, beoltottunk 400 ml-es részletekben kettő 30 liter térfogatú és 15 liter 1,5% glicerinből, 1,5% gyapotmag-lisztből, 0,2% L-aszparaginból és 0,3% nátrium-kloridból álló sterilizált táptalajt tartalmazó üvegfermentorba. Az üvegfermentorban 3 napig tenyésztettünk 27 °C-on 15 liter/perc levegőztetési sebességgel és 250 fordulat/perc sebességgel. Az így kapott fermentlé ID50 értéke észterázra vonatkoztatva 0,0017 ml/ml. A két üvegfermentor összesen 30 liter fermentlevet ad. A fermentlé leszűrésével 780 g micélium kalácsot kaptunk, amelyet kétszer extraháltunk 4 liter metanollal. Az egyesített, összesen 8 liter metanolos extraktumokat csökkentett nyomáson szárazra pároltuk és így 17,5 g nyers eszterasztin port kaptunk. A nyers port kétszer vetettük alá 1 liter vízzel és 1 liter butilacetáttal folyékony disztribúciós módszernek. A kapott butilacetátos kivonatokat (összesen 2 liter) összeöntöttük és csökkentett nyomáson szárazra pároltuk és így 6,5 g nyers eszterasztin port kaptunk (ID50=0,1 mcg/ml). 5 5. példa 6,5 g (ID50=0,1 mcg/ml), 4. példa szerint előállított nyers port 200 ml, majd 100 ml kloroformmal extraháltunk. A kloroformos extraktumokat összeöntöttük és csökkentett nyomáson 100 ml-re koncentráltuk. A koncentrált oldatot 10 g szilikagéllel (kereskedelmi név: „Wako-gel C—100”, Wako Chemicals Co., Japán) kevertük össze és az elegyet csökkentett nyomáson szárazra pároltuk, úgy, hogy az eszterasztint a szilikagél adszorbeálta. Az eszterasztint adszorbált állapotban tartalmazó szilikagélt 300 ml kloroformmal mosott szilikagél oszlop tetejére helyeztük. Miután az egész oszlopot 3 liter kloroformmal mostuk, kloroform és metanol 80: 1 térfogatarányú elegyével eluáltuk. Az eluátumot 20 g-os frakciókban összegyűjtöttük és az észteráz gátló hatás csúcsértékek körülbelül 60—160. frakcióknál jelentkeztek. Ezeket az aktív frakciókat csökkentett nyomáson szárazra pároltuk és 150 mg világos piros port kaptunk. Ez a por 0,0024 mcg/ml dózisban (IDS0) mutat észteráz gátló hatást. 6. példa 150 mg világos piros eszterasztin port (5. példa) 2 ml metanolban feloldottunk, majd 400 ml Sephadex LH—20 oszlopon kromatografáltuk, melyet metanollal felduzzasztottunk. Metanollal eluáltunk és 5 g-os frakciókban gyűjtöttük össze az eluátumokat. Az észteráz gátló hatás maximális értékek körülbelül az 54—66. frakcióknál léptek fel. Az aktív frakciókat csökkentett nyomáson szárazra pároltuk és így sárga színű port kaptunk. A por észteráz gátló hatása ID30= ==0,0007 mcg/ml. 7. példa 30 mg, a 6. példa szerint kapott sárga port 1 ml etilacetátban oldottunk, a kapott oldatot 500 mg szilikagél oldattal kevertük össze (Wako-gel C—200). Az elegyet csökkentett nyomáson szárazra pároltuk és így az eszterasztint a szilikagél tömege adszorbeálta. A szilikagél tömeget 1,2 cm átmérőjű, 20 cm magas száraz szilikagél kromatografáló oszlop tetejére helyeztük és eluálószerként etilacetátot alkalmaztunk. Az eluátumot 10 g-os frakciókban gyűjtöttük össze és az eszterasztin csak a 10—17. frakciókban jelent meg. A 10—17. aktív frakciókat csökkentett nyomáson szárazra pároltuk és így 7 mg színtelen eszterasztin port kaptunk, amely ID50 észteráz gátló hatása 0,0002 mcg/ml. 8. példa 300 ml 1,5% glicerint, 1,5% gyapotmag-lisztet, 0,3% nátrium-kloridot, 0,2% L-aszparagint és 0,005% habképzőszert (Polioxialkilén, kereskedelmi név: „Adecanol” Asahi Denka Co., Japán terméke) tartalmazó táptalajt rozsdamentes acélból levő 570 ml-es fermentorba töltöttünk, majd 120 °C-on fűtve 20 percig sterilizáltuk. Ebbe a sterilizált táptalajba 30 liter tenyészetet oldottunk, amelyet Streptomyces MD4—Cl törzs (FERM—P 3723) 27 °C-on levegőztetés és keverés közben 2 napig tartó inkubációjával kaptunk. A beoltott táptalajt 27 °C-on 48 °C-on 300 liter/perc levegőztetési sebességgel és 20 fordulat/perc keverési sebességgel inkubáltuk. Az így kapott fermentlevet leszűrve 34,2 kg micéliumot tartalmazó szűrési kalácsot kaptunk. Ezt a szűrési kalácsot kétszer 100 liter etanollal extraháltuk és az egyesített etanolos extraktumokat csökkentett nyomáson 6 literre koncentráltuk. A koncentrált oldatot kétszer 6 liter butilacetáttal extraháltuk. A butilacetátos extraktumokat összeöntöttük és csökkentett nyomáson bepárolva 128,2 g nyers eszterasztin port kaptunk, amelynek ID50 értéke 0,08 mcg/ml. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
