179657. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eszterasztin és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
13 179657 14 A fenti táblázat azt mutatja, hogy az 1 mg—250 meg beadagolása észrevehetően csökkenti a K.T.T. kifejlődését és ezért mutat az eszterasztin a celluláris immunitással szemben is elfojtó hatást. További kísérletek azt mutatják, hogy 10 mcg/ml koncentrációban az eszterasztin a tenyésztett sejtekre nézve nem mutat sejt-toxieitást. Ahogy fent említettük, a 250 mg/kg eszterasztin dózis egyik akut toxieitási vizsgálat során sem mutatja a toxieitás legkisebb jelét. A fenti adatok azt mutatják, hogy az eszterasztin hasznos mint immunoszupresszív gyógyszer, amely biztonsággal hasznosítható olyan alapon, hogy az eszterasztin teljesen más módon hat, mint az eddig ismert immunoszupresszív gyógyszerek, például 6- -merkaptopurin, azatiopurin, ciklofoszfamid, és a kortikoszteroidok, amelyek sejt toxieitása nagy és így hozzájárul ezen szerek immunitásmegszüntető hatásához. Ezért tehát az eszterasztin sok súlyos betegség, például kontakt allergiás dermatitisz, szisztémás lupusz eritematozusz, autoimmún hemolitikus anémia, artéria körüli nodozus, miaszténia gravisz, artritisz, reuma és szklerózis nultiplex kezelésére alkalmas és ezen kívül a belső szervek átültetésénél (szív, vese) a műtétkor fellépő kilökési tünetek gátlására lehet használni. A találmány szerint tehát előállítunk olyan szert, amely állaton és emberen az immúnválasz csökkentésére alkalmas immúnszupresszív gyógyszer, amely mint hatóanyagot megfelelő mennyiségű eszterasztint és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz. A találmány szerinti immúnszupresszív gyógyszert a szokásos orálisan adagolható gyógyszerkikészítési formákban, például tabletta, kapszula, por, oldat vagy szuszpenzió formájában készítjük ki vagy az eszterasztint a szokásosan alkalmazott gyógyászatilag elfogadható szilárd hordozóval, például keményítővel, szacharózzal, talkummal vagy kalciumkarbonáttal keverjük össze vagy az eszterasztint gyógyászatilag elfogadható folyékony hordozóval, például etanollal vagy vízzel oldjuk vagy szuszpendáljuk. Az eszterasztin és a szilárd vagy folyékony hordozó egymáshoz viszonyított arányát az orálisan alkalmazható készítmény formájától függően választjuk meg és rendszerint 1: 1—1: 100 között változhat. A találmány szerinti immúnszupresszív gyógyszert injektálható oldat vagy szuszpenzió formájában is kikészíthetjük, oly módon, hogy az eszterasztint 0,1—10 súly% arányban fiziológiás sóoldatban vagy gyógyászatilag elfogadható oldószerrel, például Ringer oldattal vagy alkalmas diszpergálószerrel vagy anélkül oldhatjuk vagy szuszpendálhatjuk. Az így kapott injekciós oldatot vagy szuszpenziót intravénás, intramuszkuláris vagy intraperitoneális úton adagolhatjuk be. Az eszterasztin alkalmazott dózis mennyisége a kikészítés módjától, az adagolás módjától és a kezelendő betegség fajtájától függ. A gyógyszer hatását sokféle tényező befolyásolhatja, például kor, testsúly, nem, táplálkozás módja, adagolás időpontja, adagolás módja, kiválasztás sebessége, gyógyszerkombinációk, reakció érzékenység, a beteg komolysága. Felnőtt személyeknek általában 0,5 mg/kg—100 mg/kg eszterasztint adunk. Az egy páciensnek adandó szükséges dózist adott feltételek mellett a fenti irányelveknek megfelelő módon határozzuk meg és figyelembe vesszük a már ismert immúnszupresszív gyógyszereknél, például az Immurannál (6-merkapto-purin) tapasztalt dózis mennyiséget. A találmány részleteit a következő, nem-korlátozó jellegű példákkal ismertetjük. 1. példa Streptomyces MD4—Cl törzs ferde tenyészet kacsnyi mennyiségét (FERM—P 3723) vagy (ATCC 31 336) mint eszterasztin termelő törzset beoltottunk 15 liter 1,5% glicerinből, 1,5% gyapotmag lisztből, 0,2% L-aszparaginból és 0,3% nátrium-kloridból álló táptalajba, amelyet előzőleg 100 cm3 adagokban 500 cm3 térfogatú forgó lombikokba helyeztünk és 120 °C-on 20 percig sterilizáltuk. Az inkubációt egymásutáni 10 napig 27 °C-on folytattuk 180 percenkénti fordulatszámmal, közben időnként mintát vettünk az inkubált táptalajból és az egyes mintákat megvizsgáltuk eszterasztin-tartalom szempontjából, hogy megfigyeljük, mennyire halad előre az inkubációs periódus alatt az eszterasztin termelés. Az inkubáció 2. napján az eszterasztin termelés elérte a maximumot és az észteráz gátló anyag szintjét az inkubáció 5. napjáig egy szinten tartottuk. Ezután lassan esni kezdett az eszterasztin tartalom. Az inkubált táptalaj pH-értéke az 1. napon 6,8, a 2. napon 7,2, a 3. napon 7,3, a 4. napon 7,5 és az 5. napon 6,4 között változott, majd a 6. nap után 8,0—9,0 között változott. A 3. inkubációs nap után az inkubált táptalaj nagyobb mennyiségét szűrési segédanyaggal (diatomaföld, kereskedelmi név: „Hyflo-Supercel”) leszűrtük és 12 600 ml tiszta táptalaj szűrletet kaptunk. A szűrt fermentlét elemeztük és azt találtuk, hogy az észterázgátló anyagot 0,0017 ml/szűrt lé ml mennyiségben tartalmazza és 50%-os észteráz-gátló hatást mutatott. A szűrt fermentlevet az észteráz-gátló anyag kivonására 500 ml butilacetáttal kevertük össze. A visszamaradó vizes fázist 250 ml butilacetáttal ismét extraháltuk. A butilacetátos összevont extraktumot csökkentett nyomáson szárazra pároltuk és 200 mg barna színű port kaptunk. A por ID50 értéke 0,03 mcg/ml a fenti elemzési módszerrel kimutatva. A hatóanyagot 80%-os hatásfokkal sikerült a fermentléből butilacetáttal extrahálni. 2. példa A Streptomyces MD4—Cl törzset az 1. példában leírt táptalajban és tenyésztési feltételek mellett 3 napig inkubáltuk. A kapott fermentlevet szűrtük és ily módon a micélium kalácsot eltávolítottuk. A 280 g micéliumkalácsot kétszer extraháltuk metanollal, egyszer 1500 ml metanollal, majd 500 ml metanollal. Az egyesített metanolos extraktumokat csökkentett nyomáson szárazra pároltuk. A kapott szilárd anyagot 500 ml vízben oldottuk és a vizes oldatot 500 ml vízzel extraháltuk és 200 ml butilacetáttal extraháltuk, ily módon az eredetileg a szilárd maradékban jelenlevő eszterasztin több mint 90%-át a butilacetátos fázisba oldottuk át. A butilacetátos extraktumokat összeöntöttük és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
