179655. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferon termelés fokozására
3 179655 4 mítva 60—80 mega-egység lehet (1 mega-egység 106 interferon egységnek felel meg a Medical Research Council standard interferon előállításmódja szerint, 69/19, v. ö. Finter, N. Interferons, 1973, 485—486 o., North Holland). Ez a koncentráció 109 sejtre számítva 30—40 mega-egységnek felel meg. Más esetekben a koncentráció 1 literre számítva csak 1 mega-egység vagy ennél is kevesebb (vagy 109 sejtre számítva 0,5—0,7 mega-egység), és pedig hasonló sejteket és gerjesztő körülményeket és csaknem azonos termelési feltételeket figyelembe véve. Az interferon hozamingadozása pontosan meg nem magyarázható jelenség. Interferon termeléssel foglalkozik az 1 464 939 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás is. Azonban az ott ismertetett eredmények alapján az interferon hozama meglehetősen alacsonynak adódik. (10-szer kevesebbnek a találmány szerinti megoldással elérhető hozamnál). Azt találtuk, hogy ha az interferon-termelő sejteket egy karbonsavval vagy annak sójával kezeljük, majd azokat interferon termelésre gerjesztjük, akkor az interferon reprodukálható módon viszonylag magas hozammal nyerhető ki. A bejelentés szerinti, interferon termelésére alkalmas eljárás, amelynek során az interferontermelő sejtekhez valamely gerjesztő szert adunk, azzal jellemezhető, hogy a sejteket gerjesztésük előtt hatásos, de toxikus mennyiségnél alacsonyabb koncentrációban egyenes szénláncú telített karbonsavat vagy annak sóját tartalmazó közegben inkubáljuk. Az interferon termelésre a sejteket a követelményeknek megfelelően választjuk meg, így például ha az interferont humán célokra kívánjuk hasznosítani, akkor humán-sejteket választunk. A sejtek epitheliális vagy lymphoblastoid-sejtek lehetnek, így Namalva-sejtek vagy más Iymphoblastoid-sejtvonalak. Lymphoblastoid-sejtvonalak, amelyek tenyészetben sorozatban szaporíthatok, származhatnak perifériás humán vérleukocyták tenyészeteiből ismert módon [v. ö. Hope, J. H., Horne, M. K., Scott, W., Int. J. Cancer, 3, 857—866. o. (1978), Hope, J. H., Horne, M. K., Scott, W., Int J. Cancer, 4, 255—260. o. (1969), Chang, R. S., Golden H. D., Nature, 234, 359—360. o. (1971)]. Ennek megfelelően a leukocyták normál vagy megbetegedett személyektől nyerhetők és származhatnak „spontán”, ha a sejtek már fertőzöttek Epstein-Barr vírussal (EBV); EBV-val nem fertőzött leukocyta tenyészetből is nyerhetők, például ha olyan köldökzsinórból származó vérleukocytákat tenyésztünk, amelyhez mononucleosis infectiosa-t vagy Burkitt lymphoma eredetű EBV-t adagolunk. Lymphocyta sejtvonalat Burkitt-lymphomában megbetegedett páciensek sejtjeiből vehetjük, mivel ezek már EBV-vel fertőzöttek. Egy bizonyos Namalvasejtvonalat Stockholmban Klein, G. professzor fejlesztett ki [Klein, G., Adams, A., Dombon, L., Int. J. Cancer, 12, 396—408. o. (1973)]. Ezt a sejtvonalat Namalva elnevezésű afrikai lánygyerek sejtjeiből tenyésztették ki. Ez a sejttörzs megfelelő stimuláló hatásra nagyobb mennyiségű interferon termelésre képes [Strander, H., Morgensen, K. E., Cantell, K., J. Clin. Micro., 1, 116—117. o. (1975)]. E sejtvonal másodlagos tenyészetét 1975-ben dr. Gresser Ion professzor (Villejuif, Franciaország) nyerte ki. A sejtvonalat 10% foetális borjúvétsavót tartalmazó RMPI 1640 közegben való szaporodásra adaptálták. A laboratóriumban tenyésztett sejteket ugyanilyen összetételű, de 5—7% 6—8 hónapos boíjúvérsavó adalékot tartalmazó közegben való szaporodásra adaptálták, majd kétszerháromszor hetente — 18 hónapon keresztül — másodlagos tenyészetben szaporították. Az így előállított és tárolt sej tenyészetet Namalva/WRL tenyészetnek nevezik, ampullákban tárolják cseppfolyós nitrogénnel hűtve. Ezek a sejtek mycoplasmás fertőzéstől mentesek és a törzs az ATCC (American Type Culture Collection) törzsgyűjteménybe letételre került. A következő példákban Namalva/WRL sejteket alkalmazunk. A találmány azonban felhasználható egyéb Namalva-sejtvonalak vagy egyéb lymphoblastoid sejtek alkalmazásával is. A tenyészközegben használt karbonsav előnyösen 2—8, célszerűen 3—6 szénatomos, legelőnyösebben vajsav. Ha magát a savat használjuk, akkor a különböző szervetlen vagy szerves sókat tartalmazó tenyészközegben rendszerint a sav sója képződik. Alternatív módszer szerint lehetséges az is, hogy karbonsav sóját adjuk a tenyészközeghez, ilyen esetben nátrium-, kálium- vagy ammónium-sót alkalmazunk. Az interferon előállítása céljából az erre a célra kiválasztott sejteket először olyan feltételek mellett tenyésztjük, amely megfelelő és célszerű a szakirodalomban leírt minden egyes sejttípus vagy törzs esetén, így tenyészthetünk humán lymphoblastoid sejteket, így Namalva-sejttörzs esetében a felhasznált tenyészközeg rendszerint 5—10 térfogatrész vérsavóval, például borjú vagy ló vérsavóval adalékolt RPMI 1640 közeg (Moore, G. E. és munkatársai 1967, J. Amer. Med. Assoc. 199, 519—524.). Ha az interferont lymphoblastoid sejtek, így Namalva-sejtek felhasználásával termeljük, akkor a sejttenyészetet addig szaporítjuk, amíg a szuszpenzióban megfelelő, például 0,5—lOxlO6 sejt/ml koncentráció alakul ki, ezután a sejteket célszerűen felhasználhatjuk interferon termelésére. Ebből a célból a sejtkoncentrációt 0,25—6 x 106 sejt/ml, célszerűen 0,5—3 x 106 sejt/ml, kiváltképp pedig 1 x 106 sejt/ml koncentrációra állítjuk be valamely következő közegben: a) friss tenyészközeg, b) előzőleg sejttenyésztésre használt és friss tenyészközeggel adalékolt, kimerült tenyészközeg, vagy c) friss tápanyagokkal felerősített kimerült tenyészközeg. Ebben a fázisban adagoljuk a karbonsavat vagy sóit, a sejttenyészethez, amelyben 0,1—10 mmól, előnyösen 0,2—5 mmól, kiváltképp pedig 0,5—2,0 mmól végső koncentrációt állítunk be. A karbonsavkoncentrációt a sejtekre gyakorolt toxicitás korlátozza, azonban a karbonsavnak olyan hatásos mennyiségben kell jelen lennie, hogy az interferon termelést fokozza, így egy kiválasztott sav esetében optimális egyensúlyt kell beállítani az interferon termelési hozam javulása és a sejtekre gyakorolt toxikus hatás között. Ha karbonsavként tehát nem vajsavat alkalmazunk, akkor az előbbi koncentrációhatároktól eltérő értéket állítunk be. A sejteket ezután a karbonsav alkalmazott koncentrációjától függően 33—38, előnyösen 35—37 °C között 12—72 óra hosszat inkubáljuk. Például humán lymphoblastoid-sejtek Namalva-törzsét 48 óra hosszat 1 mmól vajsavkoncentráció mellett 6,2—7,4, célszerűen 6,6—7,2 pH-érték között inkubáljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
