179655. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferon termelés fokozására
5 179655 6 A sejteket inkubálás után a karbonsavat tartalmazó közegtől elválasztjuk olyan módszerekkel, amellyel a sejtek nem károsodnak, például centrifugálissal vagy szűréssel. Ezután a sejteket ismert módon [Tovey, M. G., és munkatársai Proc. of Soc. for Exp. Biol. And Med., 146, 809—815. o. (1974)] megfelelő közegben ismét szuszpendáljuk és interferon termelésre gerjesztjük. Ilyen módszer például abban áll, hogy a sejteket vérsavótól mentes vagy legfeljebb 5 térfogatrész vérsavóval adalékolt RPMI 1640 közegben ismét szuszpendáljuk, a végső sejtkoncentráció 0,25—8 x 106 sejt/ml, előnyösen 0,5—4xl06 sejt/ml. Ezután egy megfelelő gerjesztő szert, így egy vírust, például Sendai-vírust adagolunk a sejtszuszpenzióhoz, melynek végső koncentrációját 5—200 HAU/ml (HAU=haemagglutinációs egység),előnyösen 10—50 HAU/ml értékre állítjuk be. Alapos átkeverés után a sejtszuszpenziót 34—37 °C-on 12—48 óra hosszat inkubáljuk. így például 35 °C-on a sejttenyészetet előnyösen egy éjjelen át inkubálhatjuk, eközben interferon szabadul fel a sejtekből és a közegbe megy át. A sejteket inkubálás után centrifugálással eltávolítjuk; a feliilúszóban a nyers interferon található. Ha a sejteket, mielőtt azokat interferon termelésre gerjesztenénk, előzőleg valamely egyenes szénláncú karbonsav vagy annak sója jelenlétében inkubáljuk, akkor viszonylag magas interferon hozam: literenként 5—50 mega-egység vagy ennél nagyobb hozam érhető el. Ez szignifikánsan nagyobb mennyiség, mint a kezelés nélküli érték. Ezenkívül viszonylag alacsony vérsavó adalékanyagot, így 1—2 térfogatrész vérsavót tartalmazó közegben szaporított sejtek ugyanannyi interferont termelnek fenti körülmények között, mint a 3—4-szeres mennyiségű vérsavót tartalmazó közegben szaporított sejtek. Ez a körülmény rendkívül fontos, mivel a vérsavó költsége az interferon termelési költségének egy jelentős részét teszi ki. Ha a sejteket karbonsav jelenlétében inkubáljuk, akkor az a külön előny érhető el, hogy kis mennyiségű homológ interferonnal való beoltási lépés is kiküszöbölhető, ezáltal a termelési költség csökkenthető. A találmány további részleteit a kiviteli példákban ismertetjük anélkül, hogy az oltalmi kört erre korlátoznánk. 1. példa Namalva/WRL sejtvonalhoz tartozó humán, lymphoblastoid sejteket szuszpendálunk mechanikailag kevert 10 literes edényben, amely 7% borjúvérsavóval, neomycinnel és polimyxinnel, valamint a pH szabályozására hidrogénkarbonáttal kiegészített RMPI 1640 táptalajt tartalmaz. Amikor a sejt-koncentráció 2 x10e sejt/ml-re növekszik, akkor 10 liter közeget az edényből eltávolítunk és azt egyenlő térfogatmennyiségű friss tenyészközeggel hígítjuk. Vajsavat adunk hozzá 1 mmól koncentrációban és a vegyületet 37 °C-on 48 óra hosszat inkubáljuk. Inkubálás közben a sejteket üveglombikban keverjük, a sejtszuszpenzió és a felette elhelyezkedő levegő térfogatarányát körülbelül 2: 5-re állítjuk be. Az inkubációs periódus után a sejteket 2500 fordulatszám/perc sebességgel 5 percig 20 °C-on MSE Coolspin centrifugán centrifugáljuk. A kinyert sejttömeget 2% borjúvérsavót tartalmazó RMPI 1640 közegben ismét szuszpendáljuk és a sejtkoncentrációt megbecsüljük. A sejteket 2,75 x 106 sejt/ml koncentrációra hígítjuk, majd gerjesztés céljából annyi előtermelt lymphoblastoid interferont adagolunk hozzá, hogy 100 referencia interferonegység/ml koncentráció alakuljon ki. Az interferon képzése és gerjesztése céljából 75 vörösvértest agglutinációs egység/ml végkoncentrációban Sendai-vírust adagolunk. Alapos átkeverés után a sejtszuszpenziót Thompson lombikba helyezzük (lombikonként 300 ml-t) és 35 °C-on egy éjjelen át inkubáljuk. A következő napon a sejtszuszpenziót 3000 fordulatszám/perc sebességgel 10 percig 4 °C-on Coolspin centrifugán centrifugáljuk. A nyers interferont tartalmazó felülúszót 24 óra hosszat 2 pH- értéken tartjuk, majd 4 pH-értéken tároljuk. A sejtszuszpenzió másik részét a 10 literes edényből az előzőkben ismertetett eljárással teljesen azonos módon kezeljük, azonban vajsavat nem adunk hozzá. A kontroll és vajsavval kezelt sejtek mintáit interferon tartalom szempontjából megvizsgáljuk. A kapott eredmény a következő : Kontroll sejtek: 3,75 log10 referencia interferonegység/ml, amely 6 mega-egység/liter koncentrációval ekvivalens. Vajsavval kezelt sejtek: 4,8 log10 referencia interferon-egység/ml, mely 63 mega-egység/liter koncentrációval ekvivalens. 2. példa Namalva/WRL sejteket az 1. példa szerinti közegben 2,5 x 1G6 sejt/ml koncentrációban tenyésztünk, majd 10 percig 800 x g gyorsulással centrifugáljuk. A sejtmasszát friss tenyészközegben ismét szuszpendáljuk. A sejtszuszpenziót 1,3 xlO6 sejt/ml koncentrációra hígítjuk, 50 ml-es mintákat 75 cm1 2 hasznos területű, műanyagból készült, szövettenyészetre alkalmas lombikokba helyezzük. Minden egyes lombikhoz különböző mennyiségű, foszfáttal pufferolt sóoldatban levő, 100 mmól koncentrációjú nátrium-butirátot adunk, hogy a következő koncentrációk alakuljanak ki: 0, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2 és 5 mmól. A lombikokat 36 °C-on 48 óra hosszat inkubáljuk, majd a sejteket minden egyes lombikban 800 x g gyorsulás mellett 5 percig centrifugáljuk. A kapott sejtmasszát 2 térfogat% borjúvérsavót tartalmazó RMPI 1640 közegben (fenntartó közeg) ismét szuszpendáljuk 4,3 x10e sejt/ml koncentrációra. 10 ml-es sejtszuszpenzió mintákat két-két 25 cm2-es, műanyagból készült szövettenyésztő lombikba helyezünk, ezekhez 40 HAU/ml végső koncentrációban Sendai-vírust adagolunk és ezzel az interferonképzést megindítjuk. A lombikokat 20 óra hosszat 36 °C-ra visszahelyezzük. Az egyes tenyészetek által termelt interferont úgy gyűjtjük össze, hogy a sejteket 1000 x g gyorsulással 5 percig centrifugálással ülepítjük. Az interferont tartalmazó felülúszót koncentrált sósavval 2,0 pH-értékre állítjuk be és 4 °C-on egy éjjelen át tároljuk. A következő napon 7,0 pH-értéket állítunk be és az egyes minták interferon-tartalmát mérjük. Az eredményeket az I. táblázat tartalmazza. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
