179647. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3a.alfa-h-4alfa-(3'-propanol)-7a.béta-metil-hexahidro-1,5-indandion hemiketál előállítására
3 179647 4 nek a jellemző fajai az M. phlei, M. smegmatis, M. rhodochrous, M. mucosum, M. fortuitum és M. butyricum. Különösen jól használható egy mutáns, a Mycobacterium fortuitum NRRL B—8129, amelyet az adott esetben 2—10 szénatomszámú 17-alkil-oldalláncot tartalmazó szteroidok (I) képletű vegyületté történő szelektív bontására használunk. Ilyen bontható szteroid például a szitoszterin, koleszterin, sztigmaszterin, kampeszterin és hasonló szteroidok, beleértve azokat is, melyek 2— 10 szénatomszámú 17-alkil-oldalláncot tartalmaznak, továbbá az androszt-4-én-3,17-dion, androszta-1,4- -díén-3,17-dion, dehidroepiandroszteron, tesztoszteron és a bisz-nor sav (3-ketobisznorkol-4-en-22-karbonsav). Ezeket a szteroid-alapanyagokat tisztított vagy nyers formában is használhatjuk. A fermentleben, bár kisebb mértékben, de keletkezik (II) képletű 3aa-H-4x-(3'-propanol)-5x-hidroxi-7aß-, -metilhexahidro-l-indánion hemiketál, (III) képletű 3aa-H-4a-(3 '-propionsav)-5a-hidroxi-7a ß-metilhexahidro-l-indánion-S-lakton, (IV) képletű 3a«-H-4a-(3 '-propanol)-5oc-hidroxi-7a ß-metilhexahidro-1 -indánkul és (V) képletű 3aa-H-4a-(3'-propionsav)-7aß-metilhexahidro-l,5-indándion is. A találmány szerinti eljáráshoz szükséges mutánsokat, melyek az adott esetben 2—10 szénatomszámú 17- -alkil-oldalláncot tartalmazó szteroidokat szelektíven bontják és ennek hatására a fermentlében ellenőrzött körülmények között az (I) képletű vegyület dúsul fel, a szteroid-bontó mikroorganizmusok mutagenezisével állíthatjuk elő. Ilyen szteroid-bontó mikroorganizmusok az Arthrobacter, Bacillus, Brevibacteríum, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter Serratia és Streptomyces. A találmány szerint Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 mutagenezisével állítottuk elő a laboratóriumi mutáns mikroorganizmust. Az 1974-es ATCC katalógus a következőket írja az ATCC 6482-ről : „J. C. Cruz 2. Cold abscess. Acta Med. Rio de Janeiro 1 : 1 (1936) Medium 90 37C”. M. fortuitum, ATCC 6842 nem szelektíven bontja a szteroidokat kis molekulasúlyú vegyületekké, például széndioxiddá és vízzé. így ez a mikroorganizmus nem alkalmas szteroidok szelektív bontására. Az M. fortuitum, ATCC 6842 mutagenezisénél nitrozaguanidint használva olyan mutánst állíthatunk elő, mely az adott esetben 2—10 szénatomszámú 17-alkiloldalláncot tartalmazó szteroidokat szelektíven bontja és a fermentlében főként (I) képletű vegyület dúsul fel. Ennek a mutáns mikroorganizmusnak NRRL B—8129 számot adta az U. S. Department of Agriculture Northern Regional laboratóriuma (Peroía, Illinois, U.S.A.), ahol azt az állandó gyűjteménybe letétbe helyeztük. Az M. fortuitum NRRL B—8129 morfológiája és vegyszerérzékenyséj^ alapján megkülönböztethető a szülőjétől, az M. fortuitum, ATTC 6842-től. Mindkét M. fortuitum kultúra savnak ellenálló, nem mozgó, nem spóraképző bacilus, melyek a Mycobacteriaceae családjába és az Actinomycetales rendjébe tartoznak. A Runyon-féle osztályozás szerint (Runyon, E. H., 1959. Med. Clin. North America 43, 273) ez egy nonkromogén csoport IV mycobacterium, azaz alacsony hőmérsékleten viszonylag egyszerű táptalajon gyorsan növekvő, nem pigmentált kolóniákat alkotó baktérium. Az M. fortuitum ATCC 6842 és az M. fortuitum NRRL B—8129 könnyen megkülönböztethető egymástól a szteroid molekulára gyakorolt hatásuk alapján. Mint már az előzőekben írtuk, az M. fortuitum ATCC 6842 bontja a szteroidokat, míg az M. fortuitum NRRL B—8129 szelektíven bontja azokat. Ez az M. fortuitum NRRL B—8129-nek nagyon hasznos tulajdonsága, mint az a találmány szerinti eljárásból is látszik. Az M. fortuitum ATCC 6842-nek M. fortuitum NRRL B—8129-cé történő átalakítása nitrozoguanidin segítségével történik. Az eljárás részleteit a későbbiekben ismertetjük. Bár az ilyen mutációs eljárások általában ismertek, de az ilyen típusú mutagenezisre sehol sincs utalás vagy javaslat. A találmány szerinti mutációs és transzformációs eljárást a Mycobacterium esetében írjuk le részletesen, de hasonló vagy ekvivalens eljárást más mikroorganizmusok esetében is használhatunk. A találmány szerinti szelektív transzformációt az M. fortuitum NRRL B—8129 kultúrával elvégezhetjük úgy, hogy a kiválasztott szteroidot az inkubációs periódusban adjuk hozzá a baktérium kultúrához, vagy úgy is, hogy azt a táptalajba keverjük még a beoltás előtt. A szteroidot egyedül vagy más szteroidokkal keverve is hozzáadhatjuk. A szteroidot célszerűen 0,1—100 g/liter koncentrációban alkalmazzuk. A táptalaj, amelyben a baktérium kultúra tenyészik, tartalmaz szénforrást, például asszimilálható szénhidrogének formájában és nitrogénforrást, például valamely asszimilálható nitrogén vegyület vagy fehérjeszerű anyag formájában. Előnyösen használható szénforrás például a glükóz, barna cukor, szukróz, glicerin, keményítő, kukoricakeményítő, laktóz, dextrin, melasz és hasonlók. Előnyösen használható nitrogén forrás például a kukorica lekvár, az élesztő, a tej szilárd anyagaival, autolizált sörgyári élesztő, szójabab-liszt, gyapotmag-liszt, kukoricaliszt, a kazein hasnyálmirigyből származó bomlásterméke, halliszt, karbamid, tej szilárd anyagai, alkoholdesztillációs maradékok, állati pepton oldat, hús vagy csont reszelék, ammóniumsók és hasonlók. Ezeknek a szén és nitrogén forrásoknak az elegye használható előnyösen. A fermentációs közeghez nyomelemek, például cink, magnézium, mangán, kobalt, vas és hasonlók hozzáadása nem szükséges, mert a csapvíz, vagy az egyéb nem tisztított alkotók úgyis tartalmazzák ezeket. A közeg sterilizálása előtt a pH-t körülbelül 6,5-re kell beállítani. A pH beállítás történhet erős lúgokkal, mint például nátrium-hidroxiddal, kálium-hidroxiddal és hasonlókkal. Az (I) képletű vegyület jó kihozatala érdekében nagyon fontos, hogy a találmány szerinti eljárásban a pH-t 5,5 értéken vagy kissé az alatt tartsuk a fermentáció j>orán. Célszerű a pH-t 3,0 és 6,0 közötti értéken tartani. Ezt a pH stabilizálást az ismert módszerek valamelyikével végezhetjük el, például úgy, hogy kalcium-karbonát vagy -foszfát puffert alkalmazunk a közegben, vagy a pH-t folyamatosan szabályozzuk, például nátrium-, ammónium-hidroxid és hasonló oldattal vagy savval, például sósavval, kénsawal és hasonlókkal. Továbbá a pH-t a kívánt értéken tarthatjuk a feleslegben alkalmazott tápanyagokkal is, amelyek az anyagcsere folytán alacsonyabb pH-t eredményeznek. Az ilyen anyagokra példa az oldható ammonium sók, szénhidrátok, például glükóz és egyéb mono- vagy diszacharidok, keményítő és más poliszacharidok, olajok és zsírok, például disznózsír és szójabab olaj. A transzformációs eljárás 72 órától 15 napig tart. Ezalatt a folyamat alatt az inkubációs hőmérséklet 25— 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
