179647. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3a.alfa-h-4alfa-(3'-propanol)-7a.béta-metil-hexahidro-1,5-indandion hemiketál előállítására
5 179647 6 37 °C-ig terjedhet, de előnyösen 31 °C. Az edény tartalmát eközben steril levegővel levegőztetjük és keverjük, hogy elősegítsük a mikroorganizmusok szaporodását és így növeljük a transzformációs folyamat hatásfokát. Miután a transzformációs folyamat lezajlott, amiről 5 vékonyréteg-kromatográfiával győződhetünk meg úgy, hogy adszorbensként szilikagél lemezeket (E. Merck, Darmstadt) és oldószer gyanánt 2: 3 térfogatarányú aceton-ciklohexán elegyet használunk, és az eredményül kapott, kívánt szteroidot az ismert módszerek valame- 10 lyikével kivonjuk. Például úgy, hogy fermentációs (transzformációs) reakcióelegyet a fermentáló folyadékkal és sejtekkel együtt valamely vízzel nem elegyedő, a szteroidot oldó szerves oldószerrel extraháljuk. Használható oldószerek a metilénklorid, kloroform, szén- 15 tetraklorid, etilén-klorid, triklór-etilén, éter, amil-acetát, benzol és hasonlók. Más változat szerint a fermentációs folyadékot a sejtekből először a szokásos módszerekkel, például szűréssel vagy centrifugálással elkülönítjük, majd alkalmas 20 oldószerrel extraháljuk. A sejteket akár vízzel elegyedő, akár nem elegyedő oldószerrel extrahálhatjuk. A sejtektől megszabadított fermentációs folyadékot vízzel nem elegyedő oldószerrel extrahálhatjuk. Az extraktumokat diatoma-földön keresztül átszűr- 25 hetjük és a szűrletet vákuumban szárazra pároljuk. A kapott maradék tartalmazza a keresett szteroidot, melyet Skellysolve B és 10% kloroform elegyében oldunk, és szilikagélen kromatografáljuk. Előhívószerként Skellysolve B (hexán izomerek) és etilacetát elegyét 30 használjuk, egyre növekvő etilacetát tartalommal. Ezzel a művelettel eluálhatjuk a kívánt vegyületet. Etilacetátból történt átkristályosítás után az (I) képletü vegyület, mely két epimer elegye 100—112 °C között olvad. Kristályos terméket kaphatunk, ha oldószerként például 35 etil-acetátot használunk. A keresett transzformált szteroidot a felül elhelyezkedő rétegből is megkaphatjuk, ha belőle az oldószert elpárologtatjuk. Az (I) képletű vegyület fontos szteroidok szintézisénél intermedierként használható. Például a 3 880 884 számú 40 amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljáráshoz kiindulási anyaggá konvertálható. Ez a szabadalmi leírás a 19-nor szteroidok totálszintézisét írja le. A kiindulási anyaggá történő konverziót az ismert módszerek valamelyikével végezhetjük 45 el. Lásd például J. A. C. S. 85: 2135—2137. A következő példák csupán illusztratív jellegűek, de nem korlátozzák a találmány szerinti eljárás hatáskörét. Az itt közölt százalékok mind térfogatszázalékok, hacsak külön nem jelöljük. 50 1. példa M. fortuitum NRRL B—8129 mutáns előállítása 55 M. fortuitum ATCC 6842-ből a) Nitrozoguanidines mutagenezis M. fortuitum ATCC 6842 sejteket 28 °C-on, az alábbi steril közegben: Húsleves táp (difco) Nátrium-propionát Élesztő kivonat Desztillált víz q. s. növesztünk 8 g/liter 0,5 g/liter 1 g/liter 1 liter 60 65 A pH értékét IN nátrium-hidroxiddal 7,0-ra állítjuk be, majd a közeget 121 °C-on 20 percig sterilizáljuk. A sejteket, melyek körülbelül 5 x 108/ml sűrűségűre növekednek, centrifugálással kiülepítjük, és vele azonos mennyiségű steril 0,1 mólos 5,6 pH-jú nátrium-citráttal mossuk. A kimosott sejteket újra szuszpendáljuk azonos mennyiségű citrát pufferben, amelyből a titráláshoz (sejtszámoláshoz) mintát veszünk és annyi nitrozoguanidint adunk hozzá, hogy végső koncentrációja 50 ;j.g/liter legyen. A szuszpendált sejteket 37 °C-on vízfürdőn inkubáljuk, újra mintát veszünk a meghatározáshoz, a maradékot pedig lecentrifugáljuk, és azonos mennyiségű steril 0,1 mólos 7-es pH-jú kálium-foszfáttal mossuk. Végül a sejteket egy steril, minimális sókoncentrációt tartalmazó és szenet nem tartalmazó oldatban újra szuszpendáljuk. Oldat összetétele a következő: ammónium-nitrát 1,0 g/liter dikálium-hidrogén-foszfát 0,25 g/liter magnézium-szulfát—7 víz 0,25 g/liter nátrium-klorid 0,005 g/liter vas(II)-szulfát—7 víz 0,001 g/liter Desztillált víz q. s. 1 liter A pH-t IN sósavval 7,0-ra állítjuk be, majd az oldatot 121 °C-on 20 percig sterilizáljuk. A sejteket ezután szétválasztjuk mutánsokra. b) Az M. fortuitum NRRL B—8129 mutánsok szétválasztása és izolálása A fent leírt módon mutagenizált sejteket felhígítjuk és a következő oldatot tartalmazó petri-csészékre helyezzük. (Fraser és Jerrel által módosított oldat, J. Bioi. Chem. 205: 291—295): Glicerin 10,0 g/liter dinátrium-hidrogén-foszfát 8,4 g/liter kálium-dihidrogén-foszfát 4,5 g/liter ammónium-klorid 2,0 g/liter magnézium-szulfát—7 víz 0,3 g/liter vas(III)-klorid—6 víz 0,05 g/liter Desztillált víz q. s. 1 liter Az oldathoz 15 g/liter agart adunk és az egészet sterilizáljuk 121 °C-on 30 percig, majd steril petri-csészékre öntjük. Ezen a táptalajon való növekedés kiküszöböli a mutagenezis során fellépő táplálkozási auxotrófokat, azaz az olyan kultúrák növekedését, amelyeknek vitaminokra, növekedési faktorokra stb. van szükségük ahhoz, hogy egy bizonyos kémiai közegben fejlődni tudjanak. A 7 napig tartó 28 °C-os inkubáció után a kapott tenyészeteket a mutánsok elválasztására alkalmas vizsgáló lemezekre visszük át, majd vissza a glicerin-alapú közeget tartalmazó kontroll lemezekre. A vizsgáló lemezeket Peterson, G. E., H. L. Lewis és J. R. Davis közleménye szerint készítjük el (Preparation of uniform dispersions of cholesterol and other water-insoluble carbon sources in agar media: J. Lipid Research 3: 275—276, 1962). Ezeken a lemezeken a minimális sókoncentrációt tartalmazó közeg ugyanaz, mint amit az 1. példa a) részében leírtunk. 15 g/liter koncentrációjú agart és 1,0 g/liter töménységű szénforrást, például szitoszterint vagy androszténdiont (AD) adunk hozzá és a kapott szuszpenziót 30 percig 121 °C-on sterilizáljuk. A steril, forró elegyet steril keverőedénybe öntjük, néhány percig keverjük, majd steril petri-csészékbe öntjük. Ennél a műveletnél a habzás problémát jelenthet, de ez a még forró 3
