179549. lajstromszámú szabadalom • Eljárás urokináz termelésére
3 179549 4 tionin és hisztidin pótlólagos mennyiségének hatására csak kis mértékben fokozódik az urokináz-képződés, vagy pedig egyáltalán nem nagyobb, mint a fenti aminosavak pótlólagos hozzáadása nélkül. A fenil-alaninnal kapott nagyobb kitermelést annak ellenére érjük el, hogy a tenyészetben a sejtszám (sejtsűrűség) az idővel csökken. A találmány szokásos kivitelezésénél élő vesesejteket — melyek ismert módon urokinázt képeznek - alkalmas, a sejtek növekedését serkentő tápfolyadékban mintegy 35-37 °C-on szövettenyésztő edényekben addig inkubáljuk, amíg a sejtek összefüggő réteget nem képeznek az edény alján. A „Medium 199”, melyet Morgan, Morton és Parker [Proc. Soc. Exptl. Bioi. Med. 73, 1 (1950)] szerint állítottunk elő, jellemző, sejtnövekedést serkentő tápfolyadék. A Dulbecco által módosított Eaglemédium, a McCoy-féle Medium 5A, a Waymouth-féle MB752/1 Medium és hasonló szokványos szövettenyésztő tápfolyadékok [például Morton, In Vitro 6/2, 89—108 (1970)] szintén használhatók. A növekedési fázis folyamán a tápfolyadék előnyösen egészíthető ki emlős szérummal, például fötális boíjúszérummal, általában a tápfolyadék térfogatára vonatkoztatva mintegy 5-15% mennyiségben. Miután a sejtek már összefüggő réteget képeztek, fiziológiailag elfogadható mosóoldattal, például pufferezett konyhasóoldattal mossuk, majd a mosóoldatot fenntartó tápközeggel cseréljük fel. Bármilyen vizes tápfolyadék használható, amelyről ismeretes, hogy alkalmas a vesesejtek és azok urokináz-termelésének fenntartására. A tápfolyadék előnyösen laktalbumin-hidrolizátumot, emberi szérumalbumint (HSA), glükózt és nátrium-hidrogén-karbonátot tartalmaz. A laktalbumin-hidrolizátumon kívül más fehéije-hidrolizátum is használható, mint például tripton, triptóz, pepton és hasonló anyagok. A találmány szerint a fenntartó táptalajt felemelt mennyiségű, előnyösen 0,3—0,7 súly% fenü-al an innal egészítjük ki az urokináz fent leírt, nagyobb kitermelése érdekében. Ez körülbelül 60- 140-szerese a Medium 199-ben levő fenil-alanin mennyiségének. Legelőnyösebben körülbelül 0,5% fenil-alanint használunk a fenntartó táptalajban. Úgy gondoljuk, hogy ennél lényegesen nagyobb mennyiségek mérgezőleg hatnak a sejtekre. A következő példák a találmány további ismertetésére szolgálnak, de a találmányt nem korlátozzák a példák speciális részletei. 1. példa Normális primer (közvetlenül szervezetből származó) emberi embrió-vese (HEK) sejteket [a Grand Island Biological Co. (GIBCO) cégtől szuszpenzió formájában beszerezve] lecentrifugálunk és 10 térfogat% fötális boíjúszérumot tartalmazó Medium 199-ben újraszuszpendálunk. (A szérum beszerzési forrása: KC Biologicals, Inc., Lenexa, Kansas.) A sejtszuszpenzióval 75 cm2 területű Falcon-műanyagedényeket (T—75 edények) oltunk be, amelyek szintén a fenti médiumot tartalmazzák. A beoltást úgy végezzük, hogy a tenyészet végtérfogata 15-20 ml és a sejtsűrűség 1,5-2,0 • 10s sejt/ml legyen. Az edényeket 37 °C-on 5% C02 — levegő keveréket tartalmazó termosztátban inkubáljuk. Az edényekben levő tápfolyadékot minden 2. vagy 3. napon addig cseréljük, amíg a tenyészetek sejtjei összefüggő réteget nem alkotnak. Ezután a sejteket minden edényben 25 ml steril fiziológiás konyhasóoldattal mossuk (Fisher Scientific Co., katalógusszám SO—S—442). A mosóoldat eltávolítása után 10 ml fenntartó tápfolyadékot adunk minden edényhez, a fenntartó tápfolyadék 13,65 g/liter laktalbumin-hidrolizátum médiumot (GIBCO, katalógusszám M—11), 2,2 g/ /liter nátrium-hidrogén-karbonátot, 0,1 súly% HSA-t (Sigma Chemical Co., katalógusszám A—2386), 0,1 súly% D-glükózt és 0,5 súly% L-aminosavat (fenil-alanint, metionint, hisztidint vagy glicint) tartalmaz, az alábbi 1. táblázat szerint. A fenntartó tápfolyadékból mintát veszünk az urokináz-titer meghatározásához és naponta friss, azonos fenntartó tápfolyadékkal cseréljük fel. A 4 napos sejttenyésztő szakasz után a tápfolyadékot eltávolítjuk és az összes edényben levő sejteket többször 25 ml konyhasóoldattal mossuk, majd 1 n nátrium-hidroxid-oldattal emésztjük. Ezután dezoxiribonukleinsav (DNS) meghatározást végzünk. A HEK-sejtek szokásos standard DNS-tartalma 9 Mg/106 sejt. Az 1. táblázatban feltüntetett urokináz-titerek megadásának módja: ml per nap per Mg DNS. Az urokináz-próbát kétlépcsős, jódozott fibrinlemez módszerrel végezzük el. A fibrinolízis első fázisában az urokináz a plazminogénre hat és lehetővé teszi annak plazminná alakulását. A második fokozatban a plazmin hidrolizálja a radioaktív jelzésű, megalvadt fibrinogént (fibrint) és 125J-fibrinopeptidek szabadulnak fel és kerülnek be az oldatba, melyet gamma-számlálóban lemérünk. Az urokináz-aktivitás arányos az oldatban mért radioaktivitással. 1 egység urokinázaktivitás az enzim azon mennyisége, amely óránként 1 Mg fibrint hidrolizál. A fenti urokináz-meghatározás a 125J-fibrinlemez fibrinolízisen alapuló sejtfaktor-aktivitásának mérésére szolgáló általános eljárásból (Unkeless és munkatársai, J. Exptl. Med. 137/1, 85-111 (1973)] és a fibrinogén jódozására leírt általános módszerből [Helkamp és munkatársai, Cancer Res, 20, 1495-1500(1960)] származik. 2. példa Normális primer HEK-sejteket egyenletes sejtréteg kialakulásáig tenyésztünk a T—75 edényekben a fenti 1. példában leírtak szerint, steril fiziológiás sóoldattal mossuk és a mosó folyadékot eltávolítjuk. 30 ml fenntartó tápfolyadékot adunk minden edényhez. Minden 3. napon tápfolyadékcserét végzünk friss, azonos médiummal. A fenntartó tápfolyadékban való 9 napos tenyésztés után a sejteket DNS-próbához emésztjük és meghatározzuk az urokináz-titereket. E példában a fenntartó tápfolyadék 13,75 g/liter laktalbumin-hidrolizátum tápközeget 2,2 g/liter nátrium-hidrogén-karbonátot és 0,1 súly% D-glükózt tartalmaz. A kívánt végkoncentráció eléréséig (súly%) aminosavat és/vagy emberi szérumalbumint (HSA) adunk a fenntartó alap-tápfolyadékhoz, az alábbi 2. táblázat szerint. Az 1. példához hasonlóan az urokináz-aktivitást per ml per nap per Mg NDS formájában fejezzük ki. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
