179542. lajstromszámú szabadalom • Specifikus kötésen alapuló kimutatási módszer és kompozíció antigének és haptének kimutatására
179542 mint a specifikus kötést létesítő receptorok közül a tiroxint megkötő globulint, az avidint, az úgynevezett „intrinsic factor”-t és a transzkobalamint. A találmány értelmében alkalmazott konjugátban tehát a reaktáns kapcsolva vagy kötve van egy specifikus kötésre képes anyaghoz, amely — az alkalmazott kimutatási technika szerint változóan - maga a ligandum, a ligandum egy specifikus kötési analógja vagy a ligandum egy specifikus kötőpartnere lehet. Ez a kapcsolás, illetve kötés ugyanakkor olyan, hogy a reaktáns mérhető nagyságú aktivitása vagy reakcióképessége megmarad, vagyis észlelhető. A reaktáns és a specifikus kötésre képes anyag közötti kapcsolat, illetve kötés rendszerint lényegében irreverzibilis jellegű a kimutatási technika körülményei között, azaz például a követési reakciónak rendszerint nem az a feladata, hogy egy ilyen kötést kémiailag megbontson (lásd például a fent említett lumineszcens vagy ciklusos követési reakciórendszereket). Bizonyos esetekben azonban ez a kapcsolat vagy kötés úgy van kialakítva, hogy a kiválasztott követési reakció megbontsa vagy más módon befolyásolja abból a célból, hogy a reaktáns aktivitásában bekövetkezett változás észlelhető legyen. Ilyen rendszer például a korábbiakban már referált enzimatikus fluoreszcens szubsztrátot tartalmazó reakciórendszer. A reaktáns követlenül kapcsolódhat a specifikus kötésre képes anyaghoz úgy, hogy a konjugát molekulasúlya kisebb vagy egyenlő lehet a reaktáns és a specifikus kötésre képes anyag molekulasúlyainak összegével. Rendszerint azonban a reaktánst és a specifikus kötésre képes anyagot egy olyan összekötő csoport kapcsolja össze, amely 1 és 50 közötti, előnyösen 1 és 10 közötti számú szénatomot vagy heteroatomokat, például nitrogén-, oxigén-, kén; vagy foszforatomot tartalmaz. Egyetlen atomot tartalmazó összekötő csoportra példaként megemlíthető a metiléncsoport (egy szénatom) és az aminocsoport (egy nitrogénatom). Az összekötő csoport molekulasúlya rendszerint 1000-nél kisebb és előnyösen 200-nál is kisebb. Az összekötő csoport tehát nem más, mint szénatomok vagy heteroatomok vagy a kétféle atomok kombinációjának lánca, továbbá a reaktánshoz és a specifikus kötésre képes anyaghoz vagy ezek valamelyik reakcióképes származékához egy kapcsoló csoporttal kapcsolódik, éspedig egy észter-, amido-, éter-, tioészter-, tioéter-, acetá-, metilén- vagy aminocsoporttal. A találmány értelmében alkalmazott konjugátban levő reaktáns bármely olyan anyag lehet, amelynek meghatározott aktivitása van egy előre meghatározott követési reakció egyik résztvevőjeként. Közelebbről, a jelen leírásban a „reaktáns” és „reaktáns aktivitást mutató anyag” kifejezések bármely olyan kémiai anyagra utalhatnak, amely képes egy körülhatároltan mérhető kémiai átalakulásban részt venni, amely átalakulás eredményeképpen e kémiai anyagtól eltérő termék vagy termékek képződnek, és amely átalakulás a reaktáns és valamilyen reakciót kiváltó tényező, például egy kémiai anyag (azaz egy másik reaktáns, ’ egy katalizátor vagy más típusú olyan anyag, amely részt vesz egy ilyen kémiai átalakulásban), elektromágneses sugárzás, hőenergia vagy ultrahangenergia egymásrahatásakor következik be. Az itt „reaktáns”-ként említett anyagok csoportja ezért tehát magába foglal 17 hagyományos szervetlen és szerves reagenseket és különböző biokémiai jellegű anyagokat, de nem foglal magába olyan anyagokat, mint a katalizátorok (beleértve az enzimeket is) és a radioaktív izotópok, amelyek a találmány szerinti követési reakcióban nem lehetnek reaktánsok. Szakember számára érthető, hogy bár egy adott kémiai anyag különböző eltérő kategóriákba sorolható be, minthogy kémiai környezetétől függően képes különböző, egymástól eltérő módon viselkedni, a jelen esetben a kiválasztott követési reakcióban mutatott aktivitás a döntő. Előnyösen a reaktáns egy enzimatikus reaktáns, azaz például egy enzimszubsztrát, egy koenzim vagy valamelyik reakcióképes módosulatok vagy származékuk. Az enzimszubsztrát egy olyan vegyület vagy csoport, amely képes olyan kémiai átalakulásban részt venni, amelyet egy enzim katalizál. Ha egy szubsztrátot alkalmazunk konjugátba vitt reaktánsként, molekulasúlya rendszerint kisebb 9000-nél és előnyösen kisebb 5000-nél. A konjugát előállításában ugyanis az ilyen méretű szubsztiátok alkalmazása a legelőnyösebb, minthogy az ilyen szubsztrátok molekulája még nem olyan komplex. Sőt, az ilyen szubsztiátok aktivitását — ha egy specifikus kötésre képes anyaghoz vannak kapcsolva — könnyen befolyásolni lehet a konjugát és egy specifikus kötésre képes anyag közötti reakcióval. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható enzimszubsztrátokra példaként megemlíthetjük az enzimek által bontható, fluoreszcens fényt adó szubsztrátokat, így a korábban már említett fluoreszcein-származékokat és umbelliferon-származékokat. továbbá a pH-indikátorokat és a spektrofotometriás indikátorfestékeket, különösen a kromogén típusúakat. A fenti okokból, valamint sokoldalúság és adaptálhatóság okából a koenzimek különösen előnyösen használhatók a konjugátban reaktánsként. Koenzim alatt egy olyan, nem fehéije-jellegű molekulát értünk, amely az egyik enzimfehéijétől a másikhoz vándorol, elősegítve az enzim katalitikus funkciójának kifejtéséi. Az összes ismert koenzim molekulasúlya kisebb, mint 9000, az előnyös koenzimek molekulasúlya pedig kisebb, mint 5000. A hasznosítható koenzimek közé tartoznak a nukleotid koenzimek, közelebbről az, adenincsoporthoz tartozók, így például az adenozin-foszfátok (azaz a megfelelő mono-, di- és trifoszfát), a nikotinamid-adenin-dinukleotid és redukált formái, valamint a nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát és redukált formái. További hasznosítható koenzimek a guanozin-foszfátok, a flavin-mononukleotid és redukált formái, a flavin-adenin-dinukleotid és redukált formái, a koenzim A és tioészterei (beleértve az úgynevezett szukcinil-koenzim A-t is), valamint a 3’,5’-adenozin-difoszfát és az adenozin-3’- foszfát-5’-foszfoszulfát. Az előnyösen felhasználható koenzim-aktív konjugátok olyan nukleotid koenzimekből állnak, amelyek egy adenincsoportot tartalmaznak és ehhez az adenincsoporthoz egy, specifikus kötésre képes anyag, azaz egy ligandum, a ligandum egy kötési analógja vagy a ligandum egy specifikus kötőpartnere kapcsolódik direkt kötéssel vagy egy korábban ismertetett összekötő csoporton át. Adenozin-foszfátot, nikotinamid-adenin-dinukleotidot vagy valamelyik redukált formáját vagy pedig nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfátot 18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
