179542. lajstromszámú szabadalom • Specifikus kötésen alapuló kimutatási módszer és kompozíció antigének és haptének kimutatására

179542

41 42

7. és 8. reakciók eredményével való összehasonlítása pedig azt mutatja, hogy az egyszerű Sepharose 4B jelenléte nem befolyásolja a fényt kibocsátó reakciót.

D. Kimutatási módszer

5 további specifikus kötési reakcióelegyet készítünk, mindegyik össztérfogata 0,19 ml és mindegyik 0,1 mólos, 8,0 pH-jú trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán-hidroklorid puffert 0,6 mól etanolt, 0,01 mól szemikarbazidot, továbbá az alábbi XI. táblázatban megadott mennyiségekben NAD-biotin konjugátot, szabad biotint és avidint tartalmazó Sepharose

5 4B gyanta szuszpenzióját tartalmaznak. Minden egyes reakcióelegyet úgy kezelünk, mint a példa C. részében említett, kontrollként használt reakcióelegyeket. A kapott eredményeket az alábbi XI. táblázatban adjuk meg.

10

X. táblázat

Reakció

sorszáma

NAD koncentrációja (nanomól)

NAD-biotin

konjugát

koncentrációja

Avidint tartalmazó Sepharose 4B szuszpenzió (mikroliter)

Sepharose 4B szuszpenzió (mikroliter)

Maximális

fényintenzitás

1

_

1,2

2

21

—

—

—

159

3

21

—

20

—

147

4

—

10

—

—

45,9

5

—

21

—

—

110

6

—

21

20

—

28,5

7

21

—

—

10

154

8

—

21

—

10

114

9--20

—

1,6

XI. táblázat

Reakció

sorszáma

NAD-biotin konjugát koncentrációja (nanomól)

Biotin koncentrációja (nanomól)

Avidint tartalmazó Sepharose 4B szuszpenzió (mikroliter)

Maximális fényintenzitás

10

21

___

__

79,1

11

21

—

20

17,4

12

21

79

20

43,1

13

21

158

20

59,9

14

21

158

—

79,7

A 11., 12. és 13. reakciók eredményei azt mutatják, hogy a szabad biotin és az NAD-biotin konjugát hatékonyan versenyeznek az inszolubilizált avidin kötési helyeiért, hiszen a megjelenő maximális fényintenzitás nagysága a szabad biotin koncentrációjának függvénye. A 10. és 14. reakciók eredményei viszont azt mutatják, hogy inszolubilizált avidin távollétében a jelentkező maximális fényintenzitás értéke konstans rendkívül eltérő mennyiségű szabad biotin jelenléte ellenére.

Ez a példa tehát azt bizonyítja, hogy az NAD-biotin konjugát mennyisége a folyadékfázisban fordítottan arányos a jelenlevő szabad biotin mennyiségével, így ez a módszer is alkalmas ligandumek meghatározására, illetve kimutatására. Ez a példa demonstrálja egy kemilumineszcensen mérhető koenzim használatát jelző részként specifikus kötésen alapuló kimutatási módszernél.

13. példa

50 Avidin és biotin meghatározására szolgáló, jelzőanyagként egy enzimszubsztrátot hasznosító heterogén specifikus kötéses kimutatási módszer.

Az ebben a példában használt specifikus kötési rendszer a B. reakcióvázlatban ábrázolt reakción 55 alapul.

A. Inszolubilizált specifikus kötőpartner előállítása.

60 A 12. példában ismertetett módon avidint kapcsolunk kovalensen vízben oldhatatlan polimerhez, azzal a különbséggel, hogy 100 ml, 9,0 pH-jú 0,1 mólos nátrium-hidrogén-karbonát pufferrel végzett mosás után az avidint tartalmazó Sepharose 4B gyantát 65 12 ml 0,1 mólos 8,0 pH-jú trisz-(hidroxi-metil)-ami-21